NAD激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意：正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一能夠催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或無機(jī)多聚磷酸[poly(P)]作為磷?；w進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及調(diào)節(jié)NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。
測定原理：
NADK催化NAD+磷酸化，生成NADP+；NADP+可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；在340 nm下測定NADPH增加速率?？煞从吵?/span>NADK活性的大小。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體25 mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存；
試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存；
樣本測定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑一和試劑二37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min以上。
3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入5mL試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入18mL試劑二，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
4、加樣表
試劑名稱(μL) | 測定孔 | 對照管 |
樣本 | 20 | 20 |
工作液Ⅰ | 80 | |
試劑一 | 80 |
充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min，立即煮沸
2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，25℃離心10min，取上清
上清液 | 40 | 40 |
工作液Ⅱ | 160 | 160 |
加完試劑混勻，室溫靜置15min，340nm下測定吸光值，ΔA=A測定-A對照。
NADK活性計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）NADK活力的計(jì)算:
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=53.59×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADK活力的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.107×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.
c. 用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）NADK活力的計(jì)算:
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=107.18×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADK活力的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=107.18×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.214×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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