土壤羥胺還原酶（hydroxylamine reductase,HR）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
土壤羥胺還原酶能將土壤中氮代謝過程中形成的中間產(chǎn)物羥胺還原為氨，土壤中的還原態(tài)化合物可作為氫的供體，其強(qiáng)弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氨揮發(fā)損失，間接影響氮肥的利用效率。
測定原理：
硫酸鐵銨中的Fe3+可將羥胺氧化為氮?dú)?，自身被還原為Fe2+，F(xiàn)e2+在弱酸條件下與鄰菲羅琳形成橙紅色配合物，在510nm處有吸收峰，羥胺還原酶作用于羥胺，使配合物形成量減少，510nm處吸光值的減少可反映羥胺還原酶的活性。
自備實(shí)驗用品及儀器：
天平、常溫離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、震蕩儀、氮吹儀。
試劑組成和配制：
試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體12mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體8mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：液體4mL×1瓶，4℃保存。
試劑六：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑七：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。
樣品處理：
新鮮土樣自然風(fēng)干或 37 度烘箱風(fēng)干，過 30~50 目篩。
測定操作表：
空白管 | 對照管 | 測定管 | |
風(fēng)干土樣（g） | 0.02 | 0.02 | |
試劑一（μL） | 40 | 40 | |
蒸餾水（μL） | 40 | ||
試劑二（μL） | 40 | 40 | 40 |
試劑三（μL） | 120 | 120 | 120 |
混勻后，用N2氣流排除管中空氣，立即密封，于30℃反應(yīng)1h | |||
試劑四（μL） | 80 | 80 | 80 |
充分震蕩10min，8000rpm，25℃，離心10min | |||
上清液（μL） | 20 | 20 | 20 |
試劑五（μL） | 40 | 40 | 40 |
試劑六（μL） | 20 | 20 | 20 |
試劑七（μL） | 20 | 20 | 20 |
蒸餾水（μL） | 100 | 100 | 100 |
充分混勻，25℃靜置顯色10min，用蒸餾水調(diào)零，于微量石英比色皿/96孔板測定510nm各管吸光值，分別記為A空白管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A對照管、A測定管，△A＝A空白管－（A測定管－A對照管）。 | |||
計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.185x -0.1828，R2 = 0.9992
酶活定義：每克土壤每天轉(zhuǎn)化1μg羥胺為一個酶活力單位。
HR活性（μg/d /g土樣）=（△A+ 0.1828）÷ 0.185×V反總÷W÷T
= 36.32×（△A+0.1828）÷W
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0925x -0.1828，R2 = 0.9992
酶活定義：每克土壤每天轉(zhuǎn)化1μg羥胺為一個酶活力單位。
HR活性（μg/d /g土樣）=（△A+ 0.1828）÷ 0.0925×V反總÷W÷T
=72.64×（△A+0.1828）÷W
V反總：加入提取液體積，0.28mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：1/24h
注意事項：
1. 土壤表層溶解氧濃度較大，取樣應(yīng)取表層5cm以下的土壤，否則酶活性較低或者測定不到。
2. 試劑三盡量不要敞口放置，取完立即加蓋擰緊。
3. 反應(yīng)體系最好能用氮吹儀排除溶解氧，若無此裝置，則加入試劑三后立即密封，于30℃反應(yīng)1h。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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WORD 文檔 |
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