亞鐵氧化酶（Hephaestin,HP）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/48樣
注 意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
Hephaestin (HP)作為銅藍(lán)蛋白的同系物,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內(nèi)鐵代謝。HP的表達(dá)可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調(diào)節(jié)。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+，在介導(dǎo)鐵的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中有重要作用。
測(cè)定原理：
HP催化Fe2+氧化為Fe3+，Fe2+和ferrozine反應(yīng)顯色，在560 nm下有特征吸光值。通過(guò)測(cè)定Fe2+的減少速率可測(cè)得亞鐵氧化酶的活性。
自備用品：
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體60 mL×1瓶，4℃保存;
試劑二：液體1.5 mL×1瓶，4℃保存;
試劑三：液體11 mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶液提?。?/span>
按照組織質(zhì)量（g）：水（mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560 nm。
2. 在96孔板中加入下列試劑
試劑名稱(chēng)（μL） | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
試劑一 | 50 | 50 |
試劑二 | 10 | 10 |
樣本 | 10 | 10 |
蒸餾水 | 30 | 30 |
試劑三 | 混勻，40℃靜置30 min | 100 |
試劑三 | 100 | |
混勻，立即測(cè)定A對(duì)照和A測(cè)定，ΔA=A對(duì)照-A測(cè)定。(每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管) | ||
HP活性計(jì)算:
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 8.2135x - 0.0006，R2 = 0.9998；(x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y為吸光值ΔA)
（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義：每g樣本每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個(gè)酶活力單位。
HP（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷(W× V樣÷V樣總)× 1000
= 40.58×（△A+0.0006）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個(gè)酶活力單位。
HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷（Cpr×V樣）
= 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr
V總：反應(yīng)體系體積，0.1 mL；V樣：加入樣本體積0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；1000，μmol到nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)。
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