H2S含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/96S
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
H2S是一種新型氣態(tài)信號(hào)分子，存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，生理濃度的H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過(guò)程發(fā)揮著重要的病理生理效應(yīng)。
測(cè)定原理：
H2S與醋酸鋅、N, N-二甲基對(duì)苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍(lán)，亞甲基藍(lán)在665nm處有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定其吸光值可計(jì)算H2S含量。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體16mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體8mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：液體1.5mL×1管，4℃避光保存。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清（漿）：直接測(cè)定。
操作表：
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至665nm。
2、 操作表
空白管 | 測(cè)定管 | |
樣品（μL） | 150 | |
H2O（μL） | 150 | |
試劑一（μL） | 150 | 150 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑二（μL） | 150 | 150 |
10000g，4℃，離心10min，去上清，留沉淀 | ||
H2O（μL） | 150 | 150 |
10000g，4℃，離心10min，去上清，留沉淀 | ||
試劑一（μL） | 75 | 75 |
試劑三（μL） | 75 | 75 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑四（μL） | 75 | 75 |
10000rpm，4℃，離心10min，吸取200μL上清于96孔板中 | ||
試劑五（μL） | 10 | 10 |
混勻，25℃靜置5min，測(cè)定665nm吸光值，記為A測(cè)定和A空白，ΔA=A測(cè)定-A空白。 | ||
H2S含量計(jì)算公式：
用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = 0.0022x，R2 = 0.9988
（1）組織樣品
a.按照蛋白濃度計(jì)算
H2S（nmol/mg prot）=
×V反總÷(V樣×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr
b.按照樣本重量計(jì)算
H2S（nmol/g 鮮重）=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)= 681.8×ΔA÷W
(3) 細(xì)胞
H2S（nmol/104 cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))）=681.8×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
（2）液體樣品H2S（nmol/mL）=×V反總÷V樣= 681.8×ΔA
V反總：反應(yīng)總體積，0.225mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
注意事項(xiàng)：
Z低檢出限為1nmol/mL。
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