Ca++ Mg++- ATP酶活性測定試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
注 意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
Ca++ Mg++-ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機磷。
測定原理：
根據(jù)Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性高低。
需自備的儀器及用品：
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體100mL ×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑三：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。用時加入3mL蒸餾水， 4℃保存。
試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周。
試劑六：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周。
試劑七：液體25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑八：10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑八 20倍稀釋，即取 0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制：按H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
樣品酶液的制備：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
操作步驟：
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、酶促反應（在EP管中加入下列試劑）
對照管 | 測定管 | |
試劑一（μL） | 65 | 45 |
試劑二（μL） | 60 | 60 |
試劑三（μL） | 20 | |
樣本 （μL） | 100 |
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴10min
試劑四（μL） | 25 | 25 |
樣本 （μL） | 100 |
混勻，8000g，25℃離心10min，取上清液
3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）
空白管 | 標準管 | 對照管 | 測定管 | |
0.5μmol/ml標準磷應用液（μL） | 20 | |||
上清液（μL） | 20 | 20 | ||
蒸餾水（μL） | 20 | |||
定磷試劑（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻，室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。
注意事項：
1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒100管只能測 48份Ca++ Mg++-ATP酶。
2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。避免磷污染是檢測成敗的關鍵。
3、空白管和標準管只要做一管。
Ca++ Mg++- ATPase活力的計算：
1、血清（漿）Ca++ Mg++- ATPase活力的計算:
定義：每小時每毫升血清（漿）中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力（μmol/h/mL）= [C標準管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷V樣÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）
2、組織、細菌或細胞中Ca++ Mg++- ATPase活力的計算：
（1）按蛋白濃度計算：
定義：每小時每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h / mg prot)= [C標準管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷（V樣×Cpr）÷T =7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
定義：每小時每克組織中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /g 鮮重)=[C標準管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
定義：每小時每1萬個細菌或細胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104 cell)= [C標準管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）
C標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應總體積，0.25mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
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