禽多殺性巴氏桿菌（PM）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：禽多殺性巴氏桿菌（PM）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：Pasteurella multocida Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測禽多殺性巴氏桿菌病的頭部、肝臟、脾臟組織中禽多殺性巴氏桿菌 DNA 的檢測，適用于禽多殺性巴氏桿菌感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對禽多殺性巴氏桿菌特異核酸序列設計引物和探針，用熒光 PCR 技術對禽多殺性巴氏桿菌 DNA
進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
PM 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
PM 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃避光保存，有效期 12 個月，避免反復凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺動物，無菌取疑似患病家禽的頭部、肝臟、脾臟組織。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
無菌取疑似禽多殺性巴氏桿菌病的頭部、肝臟、脾臟組織 1.0 g～5.0 g，按 10%（g/mL）加入 PBS，研磨勻漿。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取， 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿
10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑PM 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL /管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可以在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)器，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；
3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1] 嚴專強, 麥凱杰, 羅翠芬,等. 我國部分地區(qū)禽多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥情況分析[J]. 家禽科學, 2021.
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