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| 純度 | 詳詢 | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
|---|---|---|---|
| 規(guī)格 | 50T | 貨號 | YLK10357P |
| 應用領域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) | 主要用途 | 科研 |
| 中文名稱： | 免RNA提取RT-PCR試劑盒 | 英文名稱： | Cell?Lysate?RT-PCR?Kit |
| 運輸： | 低溫運輸 | 保存條件： | -20℃ |
| 有效期： | 24個月 | 自備試劑 | RT 引物、PCR 引物對 |
中文名稱：免RNA提取RT-PCR試劑盒
英文名稱：Cell Lysate RT-PCR Kit
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年
自備試劑
RT 引物、PCR 引物對
規(guī)格及成分
成 分 | 十孔盒包裝 |
溶液 A | 25 mL |
溶液 B | 0.5 mL |
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI) | 100 µL |
RT Buffer（含 dNTP） | 300 µL |
PCR MagicMix 3.0(含染料) | 9 mL |
RNase-free 水 | 10 mL |
使用手冊 | 1 份 |
使用方法
注意：無 RNase 的環(huán)境和使用無 RNase 污染的試劑是本實驗成功的關鍵。
強烈建議使用優(yōu)利科的固相 RNase 清除劑去除工作臺面的 RNase，用氣相
RNase 去除空氣中的 RNase。實驗前需要將 95%乙醇放-70℃預冷，最好用空槍頭盒盛乙醇。
一、細胞培養(yǎng)、裂解
1. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細胞、胰/酶消化并計數(shù)。
2. 轉(zhuǎn)移 1×10E5 個細胞到離心管中，400×g 離心 4 分鐘。
3. 吸棄上清（即培養(yǎng)基），保留細胞沉淀。
4. 用 0.5 mL 溶液 A 重懸細胞，并將細胞濃度調(diào)整到 2×10E5 細胞/mL。
5. 轉(zhuǎn)移 10 µL 的懸浮細胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 µL 的溶液 B，此時細胞終濃度為 10E5 細胞/mL。
6. 迅速將離心管插入浮子中，放入-70℃預冷的、95%乙醇中 1-3 分鐘。10 µL 槍頭盒一般能讓 0.2 mL 的 PCR 管一半沒入到乙醇中。
7. 在室溫的水浴鍋中快速解凍細胞，渦旋 10 秒后短暫離心數(shù)秒，將管中液體
（細胞裂解液）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，放冰上待用。
二、RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應合成 cDNA
8. 按下表設置 RT 反應體系（以 20 µL 體系為例）:
成分 | 樣品管 | 陰性對照管 |
細胞裂解液（含 RNA） | 2.5 µL | 2.5 µL |
RT Buffer（含 dNTP） | 6 µL | 6 µL |
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI） | 2 µL | 無 |
RT 引物(100ng/µL) | 1 µL | 1 µL |
RNase-free 水 | 補水到 20 µL | 補水到 20 µL |
9 . 2℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。
10. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。也可以放置在-20℃長期保存
三、PCR 方案一（RT 產(chǎn)物全部用于 PCR）
11. 在上步的 RT 反應管中直接按下表加入各成分（以 100 µL 體系為例）：
成分 | 每管加入量 |
PCR MagicMix 3.0（已加染料） | 50 µL |
自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL) | 2 µL |
RNase-free 水 | 補水到 100 µL |
12. 直接進入第 14 步。
四、PCR 方案二（部分 RT 產(chǎn)物用于 PCR）
13. 按下表設置 PCR 反應體系（以 30 µL 體系為例）：
成分 | 每管加入量 |
PCR MagicMix 3.0（已加染料） | 15 µL |
cDNA 樣品（RT 反應產(chǎn)物） | 1-5 µL |
自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL) | 1 µL |
自備反向 PCR 引物 (100 ng/µL) | 1 µL |
RNase-free 水 | 補水到 30 µL |
注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。
14. PCR 反應參數(shù)(需要根據(jù)模板和引物 Tm 值決定，下面的參數(shù)只做參考)：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 94℃ | 5 min |
PCR 反應 （35 個循環(huán)） | 94℃ | 1 min |
55℃ | 1 min | |
72℃ | 2 min | |
最后延伸 | 72℃ | 10 min |
五、電泳檢測
15. 取 5-10 µL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標準比較估計出擴增產(chǎn)物的大小。注：本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要額外再加電泳上樣液。
免RNA提取RT-PCR試劑盒
特點如下：
1. 免 RNA 提取，從細胞裂解到 RT-PCR 或?qū)崟r定量 RT-PCR 結(jié)果只需三個步驟，省略了整個 RNA 提取過程。
2. 靈敏度不低于常規(guī)方法（先提總 RNA 再進行 RT-PCR），不但可以檢測到低拷貝的 RNA，還可用于檢測 miRNA。
3. 整合了去除基因組 DNA 的步驟，只檢測 RNA，無需擔心基因組 DNA 的污染。
4. 每次只需要 10-100000 個培養(yǎng)細胞或含相應細胞數(shù)的痕量組織（如 LCM 樣品），驗證過的細胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于 U937 細胞系。
5. 兩步法 RT-PCR，后續(xù)使用靈活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的熒光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan）， 非常靈活。
6. 即適用于少量樣品，也適用于平行處理大量樣品及高通量篩查。
7. 本產(chǎn)品足夠用于 50 次 20µL 體系的 RT 和 600 次 30µL 體系（或約 200 次100µL 體系）的 PCR。
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