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柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒

產(chǎn)品名稱：柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒

本試劑盒用于體外定性檢測人咽/拭子樣本中的柯薩奇病毒 A10 型核糖核酸（RNA）。

柯薩奇病毒 A10 型(Coxsackievirus A10，CA10) 為單股正鏈RNA 病毒，屬于人類腸道病毒 A 類。CA10 為人類感染性疾病的一種病原，能引起多種疾病，如手足口病、皰疹性咽峽炎和脫甲病等。近幾年爆發(fā)的手足口病中除了主要病原體 EV71 外，還有多種人類腸道病毒參與感染，CA10 為其常見的一種。本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法，對咽/拭子樣本中的 CA10 核酸進(jìn)行定性檢測， 檢測結(jié)果僅供科研，不能單獨(dú)作為確診或排除病例的依據(jù)。

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，以 CA10 基因組編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，通過一步法RT-PCR 擴(kuò)增對 CA10 RNA 進(jìn)行定性檢測。另外，本試劑盒帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，用于對核酸提取過程及 PCR 擴(kuò)增過程的監(jiān)控，可減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

【試劑組成】

注：不同批號試劑盒的以上成分不可以互換使用； 需自備的試劑：核酸提取/試劑。

陰陽性質(zhì)控品說明：陽性質(zhì)控品為含 CA10 目的序列的假病毒溶液，濃度為 1×105copies/mL；陰性質(zhì)控品為生理鹽水。陰陽性質(zhì)控品在實(shí)驗(yàn)中均參與核酸提取。

【儲存條件及有效期】

試劑盒保存于-20±5℃，有效期 9 個(gè)月；

反復(fù)凍融次數(shù)不超過 7 次；試劑開瓶后，在 4℃儲存溫度條件下開瓶次數(shù)不超過 7 次；試劑在 4℃條件下連續(xù)保存不超過 14 天；試劑在 37℃條件下連續(xù)保存不超過 120h；運(yùn)輸采用干冰保持低溫，運(yùn)輸時(shí)間不應(yīng)超過 3 天。

試劑盒生產(chǎn)日期及失效期見產(chǎn)品標(biāo)簽。

【適用儀器】

ABI Prism 7300，ABI Prism 7500，Roche LightCycler480，DA7600。

【樣本要求】

1.  適用樣本類型：咽/拭子。

2.  樣本采集：

樣本采集對象為手足口病、皰疹性咽峽炎等患者或疑似患者，特別是發(fā)病所在地的社區(qū)或托幼機(jī)構(gòu)的 5 歲以下的兒童。

采集病人發(fā)病 3 日內(nèi)的咽/拭子樣本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有 3～5ml 保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。臨床樣本在運(yùn)輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融，如果不能確保-20℃的條件，應(yīng)該在 0～8℃運(yùn)輸和保存。樣本應(yīng)冷凍運(yùn)輸， 運(yùn)輸時(shí)要附有必要的信息，如樣本編號、發(fā)病日期和樣本采集日期。

3.  樣本保存和運(yùn)送：樣本可立即用于測試，也可保存于-20℃待測，保存期為 4 個(gè)月；長期保存，請置于-70℃。運(yùn)送采用 0℃冰壺。

【使用方法】

1.  樣本處理和核酸提?。颖咎幚韰^(qū)）

可采用本公司生產(chǎn)的核酸提取/或純化試劑（如離心柱法；磁珠法）。本試劑盒中的內(nèi)標(biāo)溶液參與提取過程，若提取試劑盒中無說明內(nèi)標(biāo)的使用方法，則可按照樣本體積：內(nèi)標(biāo)溶液體積=50:1 的比例在樣本中加入內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行核酸提取。

本試劑盒中的陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品均需要提取，用于對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控和 PCR 檢測試劑的質(zhì)控。

2.  PCR 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

2.1       大包裝規(guī)格試劑使用：

從試劑盒中取出 CA10 PCR 反應(yīng)液 A、CA10 PCR 反應(yīng)液 B，室溫融化后振蕩混勻，8,000rpm 離心數(shù)秒后使用。取 N 個(gè)（N＝待測樣本個(gè)數(shù)+陰性質(zhì)控品+ CA10 陽性質(zhì)控品）PCR 反應(yīng)管，

CA10 單人份擴(kuò)增體系配制如下表：

將各組分充分混合后進(jìn)行短時(shí)離心，以使管壁上的液體全部離心至管底，之后將 20µL 擴(kuò)增體系分裝到PCR 管中。

2.2        單管單人份規(guī)格試劑使用： 直接使用 CA10 PCR 反應(yīng)管。

3.  加樣（樣本制備區(qū)）

往上述對應(yīng)的CA10 反應(yīng)管中分別加入提取后的待測樣本核酸、陰性質(zhì)控品核酸、陽性質(zhì)控品核酸各 5µL，蓋緊管蓋，8,000rpm 離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測區(qū)。

4.  PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增檢測區(qū)）

4.1        將反應(yīng)管放入儀器樣品槽內(nèi)。

4.2      ABI Prism 7500 儀器設(shè)置（ABI Prism 7300 儀器設(shè)置參照此操作）

4.2.1 打開“Setup"窗口，按樣本對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控（NTC）、陽性質(zhì)控以及未知樣本（Unknow），并在“Sample Name"一欄中設(shè)置樣本名稱；探針檢測模式設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：NONE，Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference： NONE。

4.2.2  打開instrument窗口，設(shè)置循環(huán)條件如下： 50℃ 15分鐘，1個(gè)循環(huán)；

95℃ 15分鐘，1個(gè)循環(huán)；

94℃ 15秒→60℃ 45秒（收集熒光），45個(gè)循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。

4.3     LightCycler480儀器設(shè)置

4.3.1  打開軟件后，選擇“New Experiment"，設(shè)置檢測模式為“Multi Color Hydrolysis Probe/UPL Probe"，檢測通道為FAM， VIC。

4.3.2  設(shè)置循環(huán)條件：

4.3.3  選擇“Sample Editor"，設(shè)定樣品的名稱、類型，在“Standard Concentration"框中輸入標(biāo)準(zhǔn)品濃度，設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。

4.4      DA7600 儀器設(shè)置

4.4.1 打開軟件后，在設(shè)置程序參數(shù)界面中，設(shè)置擴(kuò)增程序和溫度設(shè)置，條件如下：

4.4.2  點(diǎn)擊樣本參數(shù)界面，按樣本對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控（NTC）、陽性質(zhì)控以及未知樣本（UNK），并在“樣本名稱"一欄中設(shè)置樣本名稱；探針染料類型選擇：FAM 和HEX 。

4.4.3 設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。

5.  結(jié)果分析(請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以 ABI7500 儀器為例)

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行

調(diào)整，Start 值可以在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，在 Log 圖譜窗口設(shè)置 Threshold 的 Value 值，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期, 陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analysis 自動獲得分析結(jié)果，在此基礎(chǔ)上，微調(diào)閾值線位置使所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2 值最大即可在“Report"窗口讀取檢測結(jié)果。

6.  質(zhì)量控制

6.1       陰性質(zhì)控品：FAM 檢測通道無擴(kuò)增曲線，VIC 檢測通道有擴(kuò)增曲線且 Ct 值＜43。

6.2   陽性質(zhì)控品：FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線，且 Ct 值＜33；VIC 檢測通道有或無擴(kuò)增曲線。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。

7.  結(jié)果判斷

7.1        內(nèi)標(biāo)結(jié)果判定：若樣品 VIC 通道 Ct＜43，則可判定該樣品內(nèi)標(biāo)陽性，若 VIC 通道無擴(kuò)增曲線或 Ct≥43，則可判定該樣品內(nèi)標(biāo)陰性。

7.2        若檢測樣品 FAM 檢測通道無擴(kuò)增曲線或 Ct≥43，且該樣品內(nèi)標(biāo)陽性，可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陰性，

7.3       若檢測樣品 FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線且 Ct≤38，可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陽性，

7.4       若檢測樣品 FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線且 38＜Ct＜43，該樣品建議復(fù)檢，若復(fù)檢結(jié)果 Ct＜43 則可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陽性；若復(fù)檢結(jié)果無擴(kuò)增曲線或 Ct≥43，可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陰性。

【陽性判斷值或者參考區(qū)間】

通過臨床樣本檢測結(jié)果分析，利用 ROC 曲線法最終確定本試劑盒的參考區(qū)間為 38～43；內(nèi)標(biāo)參考值為 43。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

1. FAM 檢測通道為陽性時(shí)，由于體系的競爭關(guān)系，內(nèi)標(biāo)可能為陰性。

2. 內(nèi)標(biāo)結(jié)果為陰性時(shí)，若該檢測管的 FAM 檢測通道也為陰性，說明體系受抑制或操作失誤，試驗(yàn)無效，需對該樣品進(jìn)行復(fù)檢。

3. 每次實(shí)驗(yàn)均需檢測陰性質(zhì)控品及陽性質(zhì)控品結(jié)果滿足質(zhì)量控制要求時(shí)方可進(jìn)行檢測結(jié)果的判定；

【檢測方法的局限性】

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本處理時(shí)沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 病毒在流行過程中的基因突變則也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

4. 由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取/試劑進(jìn)行樣本處理時(shí)的核酸提取效率存在一定差異，請使用本產(chǎn)品說明書中檢驗(yàn)方法所選用的核酸提取/試劑；

5. 本檢測結(jié)果僅供臨床參考，如需確診病例請結(jié)合臨床癥狀及其他檢測手段。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

1  試劑盒分析性能評估結(jié)果顯示：

1.1        陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率為 100％。

1.2        Z低檢測限：8.0×102copies/ml。

1.3        精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于 5%。

1.4        分析特異性

1.4.1                     交叉反應(yīng)：交叉反應(yīng)驗(yàn)證的柯薩奇病毒 A6 型、柯薩奇病毒 B 組、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腸道病毒 70 型、腸道病毒 71 型、柯薩奇病毒 A24v、埃可病毒 11 型、埃可病毒 30 型、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、副流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎鏈球菌均為來源于臨床的滅活病毒培養(yǎng)物或者細(xì)菌培養(yǎng)液，并經(jīng) PCR 或測序確認(rèn)為相應(yīng)病原體，在本試劑盒的檢測條件下，病原體濃度不高于 1.0×105copies/mL 時(shí)，檢測結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)。

1.4.2                     干擾反應(yīng)：咽/拭子樣本可能存在的內(nèi)源性物質(zhì)以及可能存在的外源性藥物紅霉/素（60mg/L）、頭孢/克洛（75mg/L）、地塞/米松（0.6mg/L）、利巴/韋林（2mg/L)、干擾素（100 單位/ml）均不影響試劑盒的檢測結(jié)果。

2  臨床試驗(yàn)：與對照方法檢測結(jié)果對比，本試劑盒檢測結(jié)果的靈敏度為 100%、特異度為 98.0%、總符合率 98.4%，Kappa 值為 0.952

（p<0.001）。

【注意事項(xiàng)】

1.  本產(chǎn)品僅用于體外檢測，實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本說明書；

2.為了避免樣本中任何潛在的生物危險(xiǎn)，檢測樣本應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，避免接觸到皮膚和粘膜；樣本的處理應(yīng)在可防止氣霧外流的生物安全柜中操作，樣本制備區(qū)所用過的試管、吸頭需打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；樣本操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：包括衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》；

3.  產(chǎn)物處理：PCR 結(jié)束之后，產(chǎn)物容易引起污染，應(yīng)由當(dāng)天不再參與實(shí)驗(yàn)的人員將所有反應(yīng)管放入生物安全垃圾處理袋或其他容器中確認(rèn)WAN全封閉后方可丟棄；

4.  全程應(yīng)避免RNA 酶污染，實(shí)驗(yàn)過程中穿工作服，佩戴一次性手套和口罩。在潔凈消毒、紫外光殺菌的化學(xué)通風(fēng)櫥或生物安全柜完成操作，避免有害物質(zhì)進(jìn)入呼吸道；

5.  使用經(jīng)高壓滅菌的一次性離心管和吸頭或購買無DNA 酶、RNA 酶的離心管和吸頭；

6.  PCR 檢測試劑使用前要WAN全解凍，8,000rpm 離心數(shù)秒后使用，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；

7.  如果在樣本處理中沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性；

實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增檢測區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；

1.  實(shí)驗(yàn)完畢用 10%次氯酸或 75%酒精處理工作臺和移液器，然后用紫外線燈照射 20-30 分鐘； 10.完成樣本核酸提取后，建議馬上進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，否則請保存于-20℃待用(24h 內(nèi))；

11. 所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；

12. 須對每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制。