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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 48T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10388P | 應用領域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | 避光-20℃以下保存 |
| 有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
口蹄疫病毒O、A、Asia-I型PCR檢測試劑盒
產(chǎn)品名稱：口蹄疫病毒O、A、Asia-I型PCR檢測試劑盒
英文名稱：Foot and Mouth Disease Virus（O、A、Asia-I）Detection Kit (Triple Channels Real-Time PCR Method)
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測口蹄疫O、A、Asia-I型病毒，對口蹄疫O、A、Asia-I型病毒引起的偶蹄獸類病的診斷和監(jiān)控具有重要指導意義。
本試劑盒針對口蹄疫O、A、Asia-I型病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含口蹄疫O、A、Asia-I型病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【試劑組成】
序號 | 組成 | 50T/盒 |
B盒 | FMDV- O、A、Asia-I RT-PCR反應液 | 750 μL×1管 |
FMDV- O、A、Asia-I逆轉(zhuǎn)錄酶 | 100 μL×1管 | |
FMDV- O、A、Asia-I Taq酶 | 150 μL×1管 | |
FMDV- O、A、Asia-I陽性對照 | 40 μL×1管 | |
FMDV- O、A、Asia-I陰性對照 | 40 μL×1管 | |
蛋白酶K | 1.2ml×1管 | |
擴增試劑盒說明書 | 1份 |
注：陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA，陽性對照為失去活性的口蹄疫O、A、Asia-I型病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】
避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 新鮮采集的咽/拭子、皰疹液和糞便標本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。
2.應避免標本間交叉污染。
3.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【使用方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
逆轉(zhuǎn)錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 FMDV-O病毒熒光信號 HEX通道采集 FMDV-A病毒熒光信號 ROX通道采集 FMDV-Asia-I病毒熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標本檢測結(jié)果解釋 | ||
FAM | HEX | ROX | |
+ | + | + | 標本中檢出口蹄疫病毒O、A、Asia-I RNA |
+ | + | - | 標本中檢出口蹄疫病毒O、A RNA，未檢出Asia-I RNA |
+ | - | + | 標本中檢出口蹄疫病毒O、Asia-I RNA，未檢出A RNA |
- | + | + | 標本中檢出口蹄疫病毒A、Asia-I RNA，未檢出A RNA |
+ | - | - | 標本中檢出口蹄疫病毒O RNA，未檢出A、Asia-I RNA |
- | + | - | 標本中檢出口蹄疫病毒A RNA，未檢出O、Asia-I RNA |
- | - | + | 標本中檢出口蹄疫病毒Asia-I RNA，未檢出O、A RNA |
- | - | - | 標本中未檢出口蹄疫病毒O、A、Asia-I RNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的Z低檢出xian時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的Z低檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。
3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
7. 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
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