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更新時(shí)間：2024-07-18 14:16:28瀏覽次數(shù)：511評(píng)價(jià)
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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | YLK10409P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實(shí)驗(yàn) | 保存條件 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 |
| 有效期 | 12個(gè)月 | 試劑盒說明 | 不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用 |
支原體通用熒光探針法PCR定量檢測試劑盒
產(chǎn)品名稱：支原體通用熒光探針法PCR定量檢測試劑盒
英文名稱：Mycoplasmaspp.Probe qPCR Kit
支原體和親緣關(guān)系很近的無膽甾原體、螺旋體統(tǒng)稱霉形體。霉形體是目前發(fā)現(xiàn)的最小的、Z簡單的原核生物。它們?nèi)狈?xì)胞壁、有變形能力、能通過濾菌器、 可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖，成為細(xì)胞培養(yǎng)中常見的一種污染源，嚴(yán)重影響細(xì)胞生長率、細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞代謝和細(xì)胞活力。因此快速靈敏檢測支原體具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)支原體高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
【試劑組成】
成 份 | 包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色蓋） |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
支原體通用探針法 qPCR 引物 混合液 | 100 μL（白蓋） |
支原體通用 qPCR 探針 | 100 μL（棕色管） |
支原體通用 PCR 陽性對(duì)照 （1×10E8 拷貝/μL） | 50 μL（黃蓋） |
核酸釋放劑 | 20 次（1mL、綠蓋） |
使用手冊 | 1 份 |
【運(yùn)輸及保存】
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。
【自備試劑】樣品 RNA。
【注意事項(xiàng)】
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
5.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性
對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)細(xì)菌 DNA/提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的細(xì)菌 DNAout 或柱式細(xì)菌 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 20 次免 DNA 提取的核酸釋放劑，本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為 PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。其使用手冊可向本公司客服索取。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
成 份 | 樣品管 N+2 個(gè) | PCR陰性對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管（2-7 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
支原體通用 qPCR 探針 | 1ul | 1ul | 各2ul |
支原體通用探針法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2 個(gè)待測 DNA 模板 | 6ul | - | - |
超純水 | - | 6μL | - |
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號(hào)） | - | - | 各 6μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…） |
11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
過程 | 溫度 | 時(shí)間 |
預(yù)變性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)） |
四、數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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