在現代生物醫(yī)學研究中，基因治療作為一種極有潛力的治療手段受到廣泛關注。而基因治療的關鍵在于高效、安全的基因載體。傳統(tǒng)的病毒載體雖然轉染效率高，但存在免疫原性、潛在致癌性等安全隱患。非病毒載體，如脂質體和聚合物納米粒等，因其安全性優(yōu)勢而成為研究熱點。
多聚賴氨酸作為一種陽離子聚合物，具有良好的生物相容性和與核酸結合的能力。硅納米材料具有更好的物理化學性質，如易于表面修飾、高穩(wěn)定性等。將多聚賴氨酸與硅納米材料結合制備新型納米粒子，有望綜合二者優(yōu)勢，開發(fā)出一種高效且低毒的細胞轉染載體。這對于推動基因治療和其他生物醫(yī)學應用具有重要意義。
材料
硅源（如正硅酸乙酯等）、多聚賴氨酸（不同分子量）、氨水（作為催化劑）、無水乙醇等有機溶劑、去離子水。同時準備用于后續(xù)實驗的核酸（如質粒 DNA）。
儀器
磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、離心機、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、動態(tài)光散射儀（DLS）、傅里葉變換紅外光譜儀（FT - IR）等。
硅納米粒子的合成
在典型的合成過程中，將硅源（如正硅酸乙酯）溶解在無水乙醇和去離子水的混合溶液中，加入適量的氨水作為催化劑。在磁力攪拌下，反應在一定溫度（如 30 - 50°C）下持續(xù)數小時。反應完成后，通過離心收集硅納米粒子，并用乙醇和水多次洗滌以去除雜質。
多聚賴氨酸的修飾
將合成的硅納米粒子分散在含有多聚賴氨酸的溶液中。通過靜電作用或化學鍵合（如硅烷偶聯劑介導）的方式使多聚賴氨酸附著在硅納米粒子表面。例如，當使用靜電作用時，硅納米粒子表面帶負電，多聚賴氨酸在合適的 pH 條件下帶正電，二者相互吸引。反應在溫和的條件下進行一段時間（如 2 - 4 小時），然后通過離心等方法分離得到多聚賴氨酸硅納米粒子。
掃描電子顯微鏡（SEM）
將多聚賴氨酸硅納米粒子樣品分散在合適的溶劑中，滴在硅片上干燥后進行 SEM 觀察?？梢钥吹郊{米粒子的大小、形狀和表面形貌。結果顯示制備的納米粒子呈現出較為規(guī)則的球形，粒徑分布在一定范圍內（如 50 - 200nm）。
透射電子顯微鏡（TEM）
TEM 可以提供更詳細的納米粒子內部結構信息。通過 TEM 觀察到多聚賴氨酸在硅納米粒子表面形成了一層均勻的包覆層，進一步證實了修飾的成功。
動態(tài)光散射儀（DLS）
使用 DLS 測量多聚賴氨酸硅納米粒子在溶液中的粒徑分布和 Zeta 電位。結果表明，納米粒子具有較窄的粒徑分布，且 Zeta 電位呈正電性，這有利于與帶負電的核酸結合。
傅里葉變換紅外光譜儀（FT - IR）
FT - IR 分析可以檢測多聚賴氨酸硅納米粒子中的化學鍵變化。在光譜中可以觀察到硅 - 氧鍵的特征峰以及多聚賴氨酸中氨基等官能團的峰，同時可以看到修飾前后峰的變化，證明多聚賴氨酸與硅納米粒子的結合。
細胞系選擇
選擇多種常用的細胞系，如 HeLa 細胞（人宮頸癌細胞系）、293T 細胞（人胚腎細胞系）等。這些細胞系在基因轉染研究中具有代表性，其生長特性和對載體的反應不同。
培養(yǎng)條件
將細胞培養(yǎng)在含有適當血清（如 10% 胎牛血清）和抗生素（如青霉素 - 鏈霉素）的培養(yǎng)基（如 DMEM 培養(yǎng)基）中，在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至合適的密度（如 70 - 80% 融合度）時，用于后續(xù)轉染實驗。
納米粒子 - 核酸復合物的制備
將多聚賴氨酸硅納米粒子與核酸（如質粒 DNA）在一定比例下混合在無血清培養(yǎng)基中，輕輕攪拌或振蕩使其充分結合形成復合物。通過改變納米粒子與核酸的質量比、孵育時間等條件來優(yōu)化復合物的形成。
轉染操作
將制備好的復合物加入到細胞培養(yǎng)板中的細胞上，在 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間（如 2 - 4 小時）。然后更換為含有血清的完整培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。設置不同的實驗組，包括不同納米粒子濃度、不同細胞系等，同時設置陽性對照組（如使用商業(yè)化的脂質體轉染試劑）和陰性對照組（只加細胞和培養(yǎng)基）。
熒光顯微鏡觀察
當使用帶有熒光標記的核酸（如綠色熒光蛋白基因的質粒 DNA）時，可以在轉染一定時間后（如 24 - 48 小時）通過熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光強度。統(tǒng)計熒光陽性細胞的比例來初步評估轉染效率。結果顯示多聚賴氨酸硅納米粒子在一定條件下能夠有效地將核酸導入細胞內，不同細胞系中的轉染效率有所差異。
流式細胞術分析
進一步使用流式細胞術對轉染效率進行定量分析。通過檢測熒光標記核酸在細胞中的表達情況，可以更準確地計算出轉染效率。與熒光顯微鏡觀察結果相印證，得到不同實驗組的準確轉染效率數據。
MTT 法
在轉染后的不同時間點（如 24、48、72 小時），采用 MTT 法檢測細胞活力。將 MTT 試劑加入到細胞培養(yǎng)孔中，在細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，MTT 被還原為紫色的甲瓚結晶。通過溶解甲瓚結晶并測量其在特定波長下的吸光度，可以反映細胞的活力。結果表明多聚賴氨酸硅納米粒子在一定濃度范圍內對細胞的毒性較低，具有較好的生物相容性。
LDH 釋放實驗
同時進行乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗。當細胞受損時，細胞膜通透性增加，LDH 會釋放到細胞外。通過檢測細胞培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性，可以評估細胞的損傷程度。實驗結果進一步證實了多聚賴氨酸硅納米粒子在轉染過程中的低細胞毒性。
硅納米粒子合成條件的影響
硅源濃度、氨水用量、反應溫度和時間等因素對硅納米粒子的粒徑和分散性有顯著影響。例如，增加硅源濃度可能導致粒徑增大，而合適的氨水用量有助于控制粒子的生長速度和粒徑均勻性。通過優(yōu)化這些條件，可以制備出粒徑合適、分散性良好的硅納米粒子，為后續(xù)多聚賴氨酸修飾提供良好的基礎。
多聚賴氨酸修飾條件的影響
多聚賴氨酸的分子量、濃度以及修飾反應的時間和溫度等對多聚賴氨酸硅納米粒子的性能也至關重要。較高分子量的多聚賴氨酸可能在納米粒子表面形成更厚的包覆層，但可能會影響納米粒子的分散性。合適的修飾條件可以使納米粒子具有良好的正電性和穩(wěn)定性，有利于與核酸結合。
納米粒子 - 核酸比例的影響
不同的納米粒子與核酸質量比會影響復合物的形成和轉染效率。當納米粒子過量時，可能會導致細胞攝取困難，而核酸過量則可能使復合物不穩(wěn)定。通過實驗確定最佳的比例范圍，可以提高轉染效率。
細胞系特異性
不同細胞系對多聚賴氨酸硅納米粒子的攝取和轉染效率不同。這可能與細胞表面受體、細胞膜通透性等細胞特性有關。例如，HeLa 細胞和 293T 細胞在相同轉染條件下轉染效率存在差異，這為針對不同細胞類型的基因治療應用提供了參考。
多聚賴氨酸硅納米粒子在低濃度下表現出較低的細胞毒性，但隨著濃度的增加，可能會對細胞產生一定的影響。這可能是由于納米粒子在高濃度下的聚集、與細胞過度作用等原因。在實際應用中，需要綜合考慮轉染效率和細胞毒性，選擇合適的納米粒子濃度，以確保在基因轉染過程中的安全性。
本文成功制備了多聚賴氨酸硅納米粒子，并對其進行了全面的表征。通過細胞轉染實驗研究了其在不同細胞系中的轉染效率和細胞毒性。結果表明，多聚賴氨酸硅納米粒子在合適的條件下具有良好的轉染性能和較低的細胞毒性，有望成為一種有潛力的基因載體。然而，還需要進一步深入研究其在體內的生物分布、長期安全性等問題，為其在基因治療等生物醫(yī)學領域的廣泛應用提供更充分的依據。未來的研究可以聚焦于優(yōu)化制備方法以進一步提高轉染效率和降低細胞毒性，以及開展更多的體內實驗研究。
4
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務