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一、引言

二、材料與方法

（一）臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1. 采集新鮮的臍帶組織，在無菌條件下將其浸泡于含有抗生素（如青霉素 - 鏈霉素混合液）的平衡鹽溶液中，充分清洗以去除血跡及雜質(zhì)。

2. 運用組織塊貼壁法，將臍帶組織剪成小段，均勻貼附于培養(yǎng)皿底部，加入含特定比例胎牛血清（如 10% - 20%）、谷氨酰胺以及生長因子（如堿性成纖維細(xì)胞生長因子 bFGF）的低糖 DMEM 培養(yǎng)基，置于 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3. 定期觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞融合度達(dá)到約 80% - 90% 時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第 3 - 5 代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

（二）電穿孔轉(zhuǎn)染實驗設(shè)計

1. 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的準(zhǔn)備：提取并純化攜帶特定報告基因（如綠色熒光蛋白 GFP 或熒光素酶基因）的質(zhì)粒，使用紫外分光光度計測定其濃度和純度，確保質(zhì)量符合轉(zhuǎn)染要求。

2. 電穿孔緩沖液的選擇：比較不同商業(yè)電穿孔緩沖液（如 Opti-MEM、RPMI 等）對轉(zhuǎn)染效果的影響，選擇最適緩沖液用于后續(xù)實驗。

3. 電穿孔參數(shù)的設(shè)置：設(shè)置多組不同的電壓（如 100V - 300V）、脈沖時間（如 5ms - 50ms）、脈沖次數(shù)（如 1 - 5 次）組合，每組參數(shù)設(shè)置至少 3 個重復(fù)樣本。

（三）電穿孔轉(zhuǎn)染操作過程

1. 收集處于對數(shù)生長期的 UC-MSCs，用預(yù)冷的電穿孔緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至合適范圍（如 1×10? - 5×10? 個 /ml）。

2. 將一定量（如 1μg - 10μg）的質(zhì)粒 DNA 與細(xì)胞懸液輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至電穿孔 cuvette 中，避免產(chǎn)生氣泡。

3. 將電穿孔 cuvette 置于電穿孔儀中，按照設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行電穿孔操作。電穿孔結(jié)束后，立即將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的完整培養(yǎng)基中，輕輕混勻后接種于培養(yǎng)板中，置于 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（四）轉(zhuǎn)染效率檢測

1. 在轉(zhuǎn)染后特定時間點（如 24 - 72 小時），使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，隨機(jī)選取多個視野，拍攝照片并統(tǒng)計綠色熒光陽性細(xì)胞的比例，以此作為轉(zhuǎn)染效率的直觀指標(biāo)。

2. 對于攜帶熒光素酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，采用熒光素酶檢測試劑盒，在化學(xué)發(fā)光檢測儀上測定細(xì)胞裂解液中的熒光素酶活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算轉(zhuǎn)染效率。

（五）細(xì)胞活性檢測

1. 采用臺盼藍(lán)拒染法，在轉(zhuǎn)染后不同時間點（如 6 小時、24 小時、48 小時）取少量細(xì)胞懸液，與臺盼藍(lán)溶液按一定比例混合，在顯微鏡下觀察未被染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞活率。

2. 運用 MTT 法，在相應(yīng)時間點向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時后，吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解形成的紫色結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀在 570nm 波長處測量吸光度值，根據(jù)吸光度值評估細(xì)胞活性。

三、結(jié)果

（一）不同電穿孔參數(shù)對轉(zhuǎn)染效率的影響

1. 電壓的影響：隨著電壓的升高，轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在較低電壓（如 100V - 150V）范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率較低，隨著電壓增加到一定值（如 200V - 250V），轉(zhuǎn)染效率顯著提高，達(dá)到峰值。當(dāng)電壓進(jìn)一步升高（如超過 250V）時，由于細(xì)胞受到過度電擊損傷，轉(zhuǎn)染效率開始下降。

2. 脈沖時間的影響：脈沖時間對轉(zhuǎn)染效率也有類似的影響規(guī)律。較短脈沖時間（如 5ms - 10ms）時轉(zhuǎn)染效率較低，隨著脈沖時間延長（如 20ms - 30ms），轉(zhuǎn)染效率逐漸增加，但當(dāng)脈沖時間過長（如超過 30ms）時，細(xì)胞損傷加劇，轉(zhuǎn)染效率降低。

3. 脈沖次數(shù)的影響：增加脈沖次數(shù)在一定程度上能夠提高轉(zhuǎn)染效率，但當(dāng)脈沖次數(shù)超過 3 次時，細(xì)胞活性明顯下降，且轉(zhuǎn)染效率的提升幅度逐漸減小。

（二）不同電穿孔參數(shù)對細(xì)胞活性的影響

1. 高電壓（如超過 250V）和長脈沖時間（如超過 30ms）均會導(dǎo)致細(xì)胞活性顯著降低，表現(xiàn)為臺盼藍(lán)拒染法檢測的活細(xì)胞比例減少，MTT 法測定的吸光度值下降。

2. 過多的脈沖次數(shù)（如大于 3 次）也會對細(xì)胞活性產(chǎn)生不利影響，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)大量死亡或增殖受抑制的現(xiàn)象。

（三）合適電穿孔轉(zhuǎn)染條件的確定

四、討論