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Flag-Nanoab-Agarose

產品貨號：FNA-25-500

儲存條件：4℃一年；-80℃長期保存，避免反復凍融

產品描述

偶聯anti-Flag-tag納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀Flag-tag (DYKDDDDK)融合蛋白。

產品優(yōu)勢

沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；

即用型，節(jié)約時間；

高親和力，高載量;

應用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定、質譜分析等；

特異性

特異性結合Flag-tag。

產品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保*密封)，或在-80℃長期保存，避免反復凍融。

實驗步驟：

收集細胞
每個免疫沉淀反應大約使用 10⁶-10⁷ 個表達Flag-tag融合蛋白的細胞，可根據Flag-tag融合蛋白表達量適當調整細胞數。

吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或胰酶消化收集貼壁細胞，細胞轉移到離心管，500g離心3min并丟棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。

細胞裂解

1.在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞。

2.置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次。
3.4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。

注意：此時細胞裂解產物可長期保存于-80℃。

結合蛋白

4.將平衡好的Flag-Nanoab-Agarose加入到細胞裂解產物中（可在細胞裂解產物中直接加入20μl該產品），于4℃旋轉混合結合1小時。根據實驗需要可調整結合時間。如果需要，留存50μl的裂解產物進行免疫印跡分析。
5.4℃，2,500g離心30秒，丟棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子
6.用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸6中的Flag-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g條件下離心30秒，丟棄上清液并重復洗滌3次。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白
方法一：
7.加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸Flag-Nanoab-Agarose。95℃，加熱10min充分變性，2,500g離心30秒收集上清，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
8.替代步驟8的可選步驟：加入50μl 0.2M pH2.5的甘氨酸洗脫結合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，2,500g離心30秒收集上清，立即加入5μl 1.0M Tris（pH10.4）以中和酸性的甘氨酸。

注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。

如果洗脫的蛋白含量少，可嘗試用2×Flag-tag進行親和純化。

可選方案
方案一：
如需進行Flag融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有Flag融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗。染色質免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，聯反應的逆轉，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定，染色質斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第4步，加入細胞裂解產物后，DNA-蛋白質復合物結合到Flag-Nanoab-Agarose上；
進入第5和6步，分離得到復合物；進入第8步，得到洗脫的復合物；后期交聯反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
Flag-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白。