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  BCA蛋白定量試劑盒

貨號：B5000

保存條件： BCA試劑A和B室溫保存，蛋白標(biāo)準請-20℃凍存。

產(chǎn)品簡介：

目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和 Bradford 蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。BCA 法與傳統(tǒng)方法相比更簡單、更穩(wěn)定、更靈敏度。BCA 法測定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響，對于 5%以內(nèi)的 SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80 具有很好的兼容性,但 BCA 法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響，在 BCA 法測定蛋白濃度前應(yīng)盡量使：EDTA 濃度≤10mM，DTT 濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。

BCA Protein Assay Kit 在 50～1000μg/ml 濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，其最小檢出量為 25μg/ml。

本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

試劑(A): BCA 試劑A      100ml

試劑(B): BCA 試劑 B      3ml

試劑(C): 蛋白標(biāo)準(BSA)    20mg

試劑(D): 蛋白標(biāo)準配制液   10ml

自備材料：

1、酶標(biāo)儀或分光光度計

2、96 孔板或 EP 管

3、恒溫箱或水浴鍋

操作步驟(僅供參考)：

1、取 1ml 蛋白標(biāo)準配制液wan全加入到含有 20mg 的蛋白標(biāo)準(BSA)中，充分溶解后配制成

20mg/ml 的蛋白標(biāo)準溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白標(biāo)準溶液應(yīng)-20℃保存。

2、取適量的 20mg/ml 蛋白標(biāo)準溶液，稀釋至終濃度為 500μg/ml 或所需濃度。如取 25μ l 蛋白標(biāo)準(20mg/ml)，加入 975μl 稀釋液，充分混勻即配制成 500μg/ml 蛋白標(biāo)準溶液。

注意：待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準也宜溶解于什么樣的稀釋液中，一般可用 0.9%NaCl 或 PBS 作為溶解 BSA 稀釋液，稀釋后的 500μg/ml 蛋白標(biāo)準溶液也應(yīng)-20℃長期保存。

3、根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑(A):試劑(B)=50:1 的比例配制 BCA 工作液，即取 50 份 BCA 試

劑 A 和 1 份 BCA 試劑B，充分混勻，即獲得 BCA 工作液(注意：正常 BCA 工作液應(yīng)為蘋果綠或墨綠色，如變?yōu)樽仙蚱渌伾珣?yīng)棄用)。

例如:取5ml BCA 試劑 A 和0.1ml BCA 試劑 B，配制成 5.1ml BCA 工作液，BCA 工作液室溫 24 小時內(nèi)穩(wěn)定。

4、將 500μg/ml 蛋白標(biāo)準溶液按 0、1、2、4、8、12、16、20μl 加到 96 孔板或 EP 管中， 加稀釋液補足至 20μl，其蛋白標(biāo)準濃度依次為 0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。

5、加 20μl 待測蛋白到 96 孔板或 EP 管中，如果樣本不足 20μl，用稀釋液補足至 20μl。注意：如果標(biāo)準品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液不同，應(yīng)在待測蛋白中加入 20μl 稀釋液；如果標(biāo)準品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液相同，無需在待測蛋白孔中加入 20μl 稀釋液，以減少不同溶液的差異。

6、向各孔或 EP 管加入 200μl 配制好的 BCA 工作液，37℃孵育 20～30min。

7、酶標(biāo)儀或分光光度計測定 562nm 波長處吸光度(如無 562nm，540～595nm 之間的波長也可)，各孔或 EP 管吸光度減去未加 500μg/ml 蛋白標(biāo)準溶液的吸光度，以求得的差值為縱坐標(biāo)：以標(biāo)準孔或 EP 管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準曲線及回歸方程， 根據(jù)標(biāo)準曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。

注意事項：

1、蛋白標(biāo)準(BSA)粉末溶解于蛋白標(biāo)準配制液后，即獲得蛋白標(biāo)準原液(即 20mg/ml 的蛋白標(biāo)準)，該原液中含有防腐劑，不影響后續(xù)檢測，該蛋白標(biāo)準原液-20℃長期保存。

2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測蛋白與蛋白標(biāo)準中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測定不準確。

3、如果檢測效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min，顏色會隨著時間的延長不斷加深，顯色反應(yīng)也會隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當(dāng)延長孵育時間或在較高溫度下孵育。

4、測定標(biāo)準曲線時發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化，可能的原因是樣品中含有嚴重干擾 BCA 法測定蛋白濃度的物質(zhì)。

5、BCA 法檢測時，待測樣本中不應(yīng)含有EGTA，否則影響檢測結(jié)果。

6、因 BCA 法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，建議每次測定時都作標(biāo)準曲線，且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，否則每次都做標(biāo)準曲線。

7、如果沒酶標(biāo)儀，也可用普通分光光度計測定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的最小測定體積，應(yīng)按比例適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于最小檢測體積，樣品和標(biāo)準品的用量亦相應(yīng)按比例放大；使用分光光度計測定蛋白濃度時，可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少，Lablead 建議把系列標(biāo)準品用量增加至 100μl，BCA 工作液用量增加至 1ml。

8、為了加快 BCA 法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過熱，否則易失效。