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Biorad siRNA合成新方法
閱讀：1899 發(fā)布時間：2008-5-26Biorad siRNA合成新方法
Bio-Rad與集成DNA技術公司（Integrated DNA Technologies，IDT聯(lián)手發(fā)展一種可以獲得有效的27-mer Dicer酶作用（Dicer-substrate）siRNA雙鏈的方法。通過這種方法可以獲得有效預設的siLentMer siRNA雙鏈。
Dicer-Substrate siRNA技術原理
之前的研究認為在沒有引起干擾素應答（interferon response）的條件下，只有21-23nt雙鏈siRNA才能激活RNAi途徑（Elbashir et al. 2001，但是來自美國希望之城國家醫(yī)學中心（the City of Hope）和IDT的研究人員證明無干擾素應答激活的前提下，27-nt的siRNA雙鏈實際上能有效的激活RNAi途徑，并且比經(jīng)典的21-mers siRNA更早激活這一途徑（Kim et al. 2005。這些研究數(shù)據(jù)表明27-nt雙鏈是由RNaseIII家族成員：Dcicer酶加工獲得的，而且27-mer siRNAs常常表現(xiàn)出比21-mer siRNA能更有效的RNA干擾效果。
siLentMer Dicer-Substrate siRNA雙鏈
因此在這一理論基礎上，IDT建立了27-mer設計運算法則（algorithm），相關生物信息學和高質量合成方法，并推出了siLentMerDicer-substrate siRNA雙鏈合成。這些雙鏈已由Bio-Rad研發(fā)部專家經(jīng)過了性能驗證和有效性驗證，可以減少至少85%的mRNA表達。除此之外，這種siRNA對于建立有效siRNA庫也很合適，多種靶標的多siRNA雙鏈合成可以產(chǎn)生復合生物學效應，有利于特異興趣基因的確定敲除。
減少脫靶效應
當siRNA序列與興趣基因非特異性序列mRNA轉錄本相似的時候就會產(chǎn)生脫靶效應（off-target effects）（Jackson et al. 2003），這會引起基因表達譜的錯誤識別，從而導致與目標基因無關的轉錄本沉默。
為了避免這種情況出現(xiàn)，siLentMer siRNA雙鏈：
＊ 利用先進的生物信息學對敲除特異性同源序列進行分析，確保特異靶標。
＊ 低濃度（≥5 nM）有效性：在siRNA高濃度的時候才會發(fā)生脫靶效應，為了減少這一效應，siLentMer siRNA在低濃度時提高了有效性（見下圖）。
＊ HPLC級純化siRNA保證了一致和可靠的結果。
siLentMer siRNA雙鏈在低siRNA濃度的有效敲除
HeLa細胞用10 nM 或者100 pM anti-GAPDH siRNA進行轉染，轉染后48小時提取總RNA，進行iScript cDNA 合成試劑盒和iCycler iQ實時監(jiān)控RT-qPCR分析，結果發(fā)現(xiàn)GAPDH轉錄水平
，相對于非沉默對照
，已經(jīng)減少了至少95%
，相對于非沉默對照，已經(jīng)減少了至少95%除此之外，序列有效性Anon. 2003和足夠的實驗對照也能減少脫靶效應的產(chǎn)生，siLentMer siRNA包含了陽性和陰性對仗，能確保沉默和簡便結果分析。
參考文獻：
Anonymous author, Whither RNAi?, Nat Cell Biol 5, 489–490 2003
Elbashir SM et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494–498 2001
Jackson AL et al., Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi, Nat Biotechnol 21, 635–637 2003
Kim DH et al., Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potencyefficacy, Nat Biotechnol 23, 222–226 2005