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純化無標簽的重組蛋白:Profinity eXact融合標簽表達系統(tǒng)
閱讀：3149 發(fā)布時間：2008-8-6
摘要：
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親和標簽已成為后基因組學時代純化重組蛋白常用手段。此方法無需了解蛋白質的生化特性或生理活性，就可通過帶標簽的重組融合蛋白選擇性地與層析基質上的配體結合，從而得以純化任何蛋白質。此方法與常規(guī)的層析方法不同之處在于，針對不同的蛋白質需要開發(fā)特定的配體和方法。采用保護蛋白質結構和功能完整性的溫和條件，已成功地通過一步親和層析從粗提物中純化出了多種重組蛋白，純度達90％以上。（Arnau et al. 2006）。
然而，對于蛋白質的結構研究和治療或診斷試劑的應用，我們期望獲得天然的無標簽蛋白，以避免親和標簽所帶來的潛在干擾（Arnau et al. 2006, Bucher et al. 2002）。因此需要用蛋白酶剪切純化的融合蛋，然后再經親和層析去除蛋白酶和切除的融合標簽從而獲得天然純品。然而針對某些特定的融合蛋白，此剪切過程比較困難。另一體系采用內含肽對融合蛋白進行自我剪切從而獲得天然N 端的重組蛋白。然而，這一自我剪切過程很緩慢并大大依賴于內含肽與目的蛋白連接處的氨基酸序列（Waugh 2005），因此限制此方法應用于重組蛋白的純化。
Profinity eXact 純化介質是Profinity eXact 融合標簽系統(tǒng)的一部分，該系統(tǒng)可在E.coli 中高表達重組蛋白并對其進行純化。它將親和層析純化和標簽的去除整合成一步，從而解決了親和層析純化的重組融合蛋白到獲得天然重組蛋白的技術壁壘（Ruan et al, 2004）。將目的蛋白的編碼序列克隆至Profinity eXact pPAL7表達載體的Profinity eXact 標簽的下游，從而產生了N 端帶有標簽的重組蛋白（圖1）。固定在Profinity eXact純化介質上的突變的絲氨酸蛋白酶選擇性地與Profinity eXact 標簽結合（Kd< 100 pM）(Ruan et al, 2004)。通過結合后的清洗過程去除宿主細胞的雜質，然后加入F－或N3－地誘發(fā)了親和標簽與目的蛋白之間的酶切，從而導致Profinity eXact 標簽被固定的蛋白酶滯留在介質上，僅預期的重組蛋白從層析柱上洗脫，且無需其它處理即可將其進行下游應用。
圖1 Profinity eXact pPAL 載體
我們利用Profinity eXact 融合標簽系統(tǒng)純化了多種不同分子量的蛋白，并用各種參數(shù)測試了它的性能。數(shù)據(jù)顯示了該新型純化系統(tǒng)的有效性，包括選擇性的捕獲帶標簽蛋白、親和標簽柱上的剪切，及整體有效并簡便的純化過程。對用Profinity eXact 純化介質裝填的Profinity eXact mini spin 層析柱和Bio-Scale層析柱進行柱性能評價，評價參數(shù)有多次純化和再生循環(huán)后介質的穩(wěn)定性及在變性劑如尿素存在時介質的功效。
方法
在非變性條件下純化重組蛋白
用于本研究的Profinity eXact 融合標簽蛋白都在E.coli 中高表達，并采用Profinity eXact 純化介質裝填的Profinity eXact mini spin 層析柱或Bio-Scale層析柱進行純化，整個過程遵循Profinity eXact 系統(tǒng)提供的操作手冊。
測試多次再生循環(huán)Profinity eXact 純化介質的穩(wěn)定性
采用1 ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 層析柱，在BioLogic DuoFlowTM 層析儀上，對重組的麥芽糖結合蛋白（MBP）進行連續(xù)5 次純化。每次純化過程中，先用5 CV Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液（0.1M 磷酸鈉緩沖液，pH7.2）平衡Profinity eXact 層析柱，然后將9 ml 含Profinity eXact 融合標簽的MBP E.coli裂解液通過上樣環(huán)以1 ml/min 的流速上柱，再用10 CV 洗滌緩沖液清洗層析柱以去除宿主細胞雜蛋白。接著用Profinity eXact 洗脫緩沖液（0.1 M 磷酸鈉，0.1 M 氟化鈉，pH7.2）以0.1 ml/min 流速在室溫條件下流經柱床30 分鐘，從而引發(fā)MBP 的洗脫。zui后用6 CV 0.1 M 磷酸以2 ml/min 的流速剝離Profinity eXact介質上的親和標簽從而再生層析柱，再用15 CV Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液平衡層析柱。每次純化過程，目的蛋白的洗脫通過分光光度計檢測A280 吸收值進行監(jiān)控，采用BioFracTM 收集器每2 ml 收集一組分。zui后用BioLogic DuoFlow 軟件對5 次層析圖譜進行比對。每次純化獲得的MBP 量通過合并收集組分的A280 值及MBP 消光系數(shù)1.61A280 = 1 mg/ml 計算得到，MBP 的純度如下所述采用SDS-PAGE 和ExperionTM 自動電泳系統(tǒng)進行測定。
存在尿素的情況下純化MBP將凍干的作為對照的Profinity eXact 融合標簽MBP 的E.coli 裂解物重懸于5 ml 含0，2，或4M 尿素的Profinity eXact 結合/洗滌緩存液中，然后將重懸的裂解液上到用各自重懸液平衡的Profinity eXact 層析柱上，用10 CV 重懸液洗滌去除宿主細胞的雜蛋白后，再用含各自濃度尿素的Profinity eXact 洗脫緩沖液以0.1 ml/min 流速在室溫條件下作用30 分鐘從而洗脫MBP。MBP 的純度如下所述采用SDS-PAGE 和ExperionTM 自動電泳系統(tǒng)進行測定。
SDS-PAGE 分析
純化的重組蛋白與各自樣品緩沖液混合，95℃變性5 分鐘后上樣到SDS-PAGE 膠上，用XT MES 電泳緩沖液在CriterionTM XT 4-12% Bis-Tris gel 上，或用1×Tris-glycine-SDS 電泳緩沖液在CriterionTM 4-20%Tris gel 上進行SDS-PAGE 電泳，電泳參數(shù)為200 V, 60 分鐘。電泳后，蛋白膠用Bio-SafeTM 考馬斯亮藍G-250在室溫下固定染色1 小時，再用水在室溫下脫色16－24 小時。脫色膠用Molecular imager® GS-800 成像儀進行顯色，然后再用Quantity One® 1-D 分析軟件的條帶工具進行分析。
Experion Pro260 分析
根據(jù)Experion Pro260 分析kit 的操作指南，用Experion 自動電泳系統(tǒng)在還原條件下進行蛋白分離與分析，蛋白純度和相對量可通過Experion 軟件自行計算。
結果和討論
在非變性條件下純化無標簽重組蛋白
我們利用Profinity eXact 融合標簽系統(tǒng)克隆表達并純化了多種原核和真核蛋白，這些蛋白分子量和寡聚體差異較大，其中一些蛋白的性質已明確，而另一些蛋白的結構特性和生物學功能尚未確定。表1 列出了利用Profinity eXact 無標簽系統(tǒng)通用操作指南，無需針對每一蛋白進行優(yōu)化，即可獲得滿意純度的無標簽融合蛋白。對于分子量較大的蛋白（>100 kD），如四聚體β半乳糖苷酶，延長結合時間以提高蛋白得率。根據(jù)操作指南，添加亞飽和劑量的寡聚蛋白至層析柱中，以確保融合蛋白在柱體加工*。鑒于用Profinity eXact 系統(tǒng)純化了多種蛋白，可見重組融合蛋白通過Profinity eXact 標簽與介質結合具有高度選擇性，且與融合蛋白的序列或結構無關。利用Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液可輕易地去除已上樣層析柱中的來自表達宿主細胞的雜質，且通常無需增加清洗的力度。通常存在的雜質是目的蛋白的截短片段，這是由于蛋白轉錄或翻譯不*所導致，并且這一現(xiàn)象在純化N 端帶標簽融合蛋白時經常發(fā)生。
即使目的蛋白間的一級結構和三級結構差異較大，融合蛋白的柱上剪切也是非常有效和可靠的。某些內切酶商品，如重組腸激酶和factor Ⅹa 存在非特異性剪切，而由于Profinity eXact 標簽的非枯草桿菌蛋白酶剪切基序與酶存在廣泛的結合，從而排除了酶對目的蛋白的非特異性剪切。事實上我們實驗數(shù)據(jù)也證實了這一特性。純化的poly-ADP 核糖聚合酶突變體和洋芹糖合酶具有各自*生物學活性（數(shù)據(jù)未顯示），這表明在溫和條件下通過一步純化并切除標簽的過程可保留這些蛋白的生理活性。
用1 ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 層析柱在Biologic DuoFlow層析儀上可純化獲得4 mg 無標簽GFP突變體，純度達98％（圖2）。此外，如純化MBP 所示，除了得率不同之外，用Bio-ScaleTM 層析柱和minispin 層析柱純化GFP，兩者性能無明顯差別（圖3）。這點對從實驗規(guī)模放大到制備級規(guī)模非常重要。
圖2. 無標簽GFP 突變體的純化。A, 在Biologic DuoFlow 層析儀上利用Bio-Scale Mini Profinity eXact 層析柱從E.coli 裂解液中純化GFP 突變體的層析圖譜。B, GFP 純化過程中收集組份的SDS-PAGE 分析。Lane 1, Precision Plus Protein 標準品；Lane 2, E.coli 粗提物；Lane 3,流穿組份中宿主雜質蛋白；Lane 4, 用Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液清洗層析柱流出的宿主雜質蛋白；Lane 5, 洗脫的GFP; Lane 6, Precision Plus Protein 標準品。取3μg 純化的蛋白進行SDS-PAGE，從而測得GFP純度達98％。
圖3. MBP 的純化。A，在Biologic DuoFlow 層析儀上利用1 ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 層析柱純化MBP，收集的組份進行SDS-PAGE 分析。Lane 1, Precision Plus Protein 標準品；Lane 2, E.coli 粗提物；Lane 3,流穿組份中宿主雜質蛋白；Lane 4,用Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液清洗層析柱流出的宿主雜質蛋白；Lane 5, 洗脫的MBP; Lane 6, Precision Plus Protein 標準品。B，利用Profinity eXact Mini spin 層析柱純化MBP，收集的組份進行SDS-PAGE 分析。Lane 1, Precision Plus Protein標準品；Lane 2, E.coli 粗提物；Lane 3,流穿組份中宿主雜質蛋白；Lane 4, 用Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液清洗層析柱，收集的組份1 中的宿主雜質蛋白；Lane 5, 用Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液清洗層析柱，收集的組份2 中的宿主雜質蛋白；Lane 6, 洗脫的MBP; Lane 7, Precision Plus Protein 標準品。C，用Experion Pro260 分析kit 在Experion 自動電泳儀上進行洗脫MBP 純度分析所得電泳圖譜。LM，低分子量marker，UM，高分子量marker。
Profinity eXact 純化介質的穩(wěn)定性和可再生性
Profinity eXact 純化介質可再生并多次用于純化融合蛋白。這已通過在BioLogic DuoFlow 層析儀上用1ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 親和層析柱連續(xù)5 次純化MBP 得以證實。目的蛋白洗脫過程中被固定的蛋白酶所滯留的Profinity eXact 親和標簽，可用0.1 M 磷酸剝離，再生后的層析柱再用Profinity eXact 結合/洗滌緩沖液平衡以進行連續(xù)純化。圖4A 對5 次純化MBP 的層析圖進行了疊加，詳細的數(shù)據(jù)分析顯示5次連續(xù)純化后，該層析柱保留了90％的結合載量（圖4B），為了顯現(xiàn)雜質采用相對高上樣量以檢測每次純化MBP 的純度，結果顯示每次純度均>99%（圖4C）。
圖4. Profinity eXact 純化介質的穩(wěn)定性和可再生性。A，在BioLogic DuoFlow 層析儀上用1 ml Profinity eXact 親和層析柱純化MBP 多次，并將每次層析圖譜進行疊加；B，1 ml Profinity eXact 層析柱多次循環(huán)使用后，MBP 結合載量的變化；C，SDS-PAGE 分析每次洗脫的MBP 的純度。Lane 1, 含Profinity eXact 標簽的融合MBP 的E.coli 裂解液；Lane 2, Precision Plus Protein 標準品；Lane 3-7，連續(xù)5 次洗脫的MBP 各取3μg 上樣；Lane8， Precision Plus Protein 標準品。
| 在存在尿素的條件下純化重組蛋白 盡管E.coli 是表達外源蛋白常用的宿主細胞，但過表達的重組蛋白在E.coli 聚集仍是獲得天然活性分子的主要屏障。在進行層析分離前需用強變性劑，如尿素和鹽酸胍溶解聚集的蛋白。為了測試Profinity eXact 是否適用這些層析條件，我們在MBP 裂解液中添加入不同濃度的尿素以評價Profinity eXact 純化介質的性能。我們發(fā)現(xiàn)該介質在存在4 M 尿素的情況下仍保留其結合載量、選擇性和剪切活性（圖5 和表2）。然而，結合緩沖液含高于4 M 的尿素，則導致洗脫組份中雜質含量升高（目的蛋白純度下降），目的蛋白得率明顯下降（數(shù)據(jù)未顯示）。值得注意的是鹽酸胍不適用于純化ProfinityeXact 融合蛋白。用鹽酸胍溶解重組蛋白后，在重組蛋白的捕獲過程中，Cl－可引發(fā)固定的突變的枯草桿菌酶過早地對融合蛋白進行酶切，從而導致目的蛋白損失。 |  圖5. 在BioLogic DuoFlow 層析儀上用1ml Profinity eXact親和層析柱，在變性和非變性條件下純化MBP，并進行SDS-PAGE分析。Lane 1,Precision PlusProtein標準品；Lane 2,用Profinity eXact洗脫緩沖液洗脫的3μg MBP；Lane3, 用含2M尿素的Profinity eXact 洗脫緩沖液洗脫的3μg MBP；Lane 4, 用含4M尿素的Profinity eXact洗脫緩沖液洗脫的3μgMBP。 |
結論
我們已利用Profinity eXact 融合標簽系統(tǒng)純化了多種無標簽的重組蛋白。該系統(tǒng)是目前僅有的采用通常操作手段僅一步層析過程，即可獲得*去除標簽的重組蛋白。通常的親和標簽純化及去除需要條件優(yōu)化，并且很費時，而利用Profinity eXact 系統(tǒng)制備無標簽、N 端無任何其它殘基的重組蛋白只需大約1 小時。該親和介質較為穩(wěn)定，可多次用于目的蛋白的純化，從而節(jié)約了成本。同時，我們證實了Profinity eXact純化介質的結合和柱上剪切特性可在高達4 M 尿素的情況下得以實現(xiàn)。因此，該系統(tǒng)適用于純化以不溶的聚集體形式存在的重組蛋白。Profinity eXact 融合標簽系統(tǒng)的有效性和一致性將使其成為獲得高產率無標簽重組蛋白的通用平臺。