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            生物分子類實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理匯總-4

            閱讀:520          發(fā)布時(shí)間:2014-12-8

            九、RT-PCR

            RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在*條件下進(jìn)行。

            實(shí)驗(yàn)步驟:

            1、RNA的提取;

            2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;

            3、PCR擴(kuò)增;

            4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。

            十、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q—PCR)(Real-time Quantitative PCR )

            利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

            閾值:是循環(huán)開始3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期。

            C(t)值:熒光信號(hào)(擴(kuò)增產(chǎn)物)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。

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