化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
生物分子類實驗室常用實驗技術(shù)原理匯總-5
閱讀：426 發(fā)布時間：2014-12-9十一、BCA法測蛋白質(zhì)濃度
十二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α）制備
1、前夜接種受體菌（DH5?或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)到第二日（約16小時）；
2、取1ml已培養(yǎng)到第二日的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；
3、將0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；
4、吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；
5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
6、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；
7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
8 、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸?。?/span>
9 、細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護(hù)劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。
十三、堿變性提取質(zhì)粒DNA
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
十四、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選
（1）總過程：
分---PCR分離目的基因
切---限制性內(nèi)切酶切割
接---目的基因與載體相連
轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞
篩---篩選陽性重組體
（2）分---PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫篩選
（3）切---限制性內(nèi)切酶切割：粘性末端、平末端
（4）接---目的基因與載體相連
原 理：利用DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個或者幾個A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補(bǔ)配對,經(jīng)連接酶作用,完成與載體的連接。
（5）轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞
感受態(tài)細(xì)胞：經(jīng)過電擊、 CaCl2、 RuCl等化學(xué)試劑處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細(xì)胞的狀態(tài)。
（6）篩---篩選陽性重組體
十五、RNA干擾（RNAi）
一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。