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技術(shù)文章
生物分子類實驗室常用實驗技術(shù)原理匯總-6
閱讀：691 發(fā)布時間：2014-12-9十六、cDNA 末端快速擴(kuò)增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)
cDNA 末端快速擴(kuò)增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)是一種基于mRNA反轉(zhuǎn)錄和 PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點,擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域,從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡單的說就是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長cDNA5’和cDNA3’末端，進(jìn)而獲得獲得全長cDNA簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、等優(yōu)點,可同時獲得多個轉(zhuǎn)錄本。因此近年來RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫篩選技術(shù),成為克隆全長cDNA序列的常用手段。
十七、基因文庫和cDNA文庫的構(gòu)建（看課本上的）
十八、mRNA差異顯示技術(shù)（DD-PCR）
mRNA差異顯示技術(shù)是將mRN A逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。每一種細(xì)胞（包括同一組織細(xì)胞經(jīng)過不同的處理）都有其特異表達(dá)的不同于其他組織細(xì)胞的基因譜（有差異基因表達(dá)），即特異的RNA指紋圖譜。差異基因表達(dá)是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，正是這些基因在細(xì)胞中的特異表達(dá)與否，決定了生命歷程中細(xì)胞的發(fā)育和分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老和凋亡等。mRNA DDR T－PCR 技術(shù)正是對組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快速而行之有效的方法。 其基本原理是從基因背景相同的2個或幾個被比較的細(xì)胞系或組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，用不同引物對，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增時加入同位素標(biāo)記的核苷酸。利用測序膠電泳技術(shù)分離PCR 產(chǎn)物，經(jīng)放射自顯影即可找到差異表達(dá)的基因。
十九、抑制差減雜交
抑制差減雜交技術(shù)原理抑制差減雜交技術(shù)(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差減雜交方法相結(jié)合的方法。其依據(jù)的主要技術(shù)有兩點:(1)消減雜交;(2)抑制PCR。經(jīng)抑制差減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達(dá)基因(目的基因),而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除,使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。
抽提兩種不同來源組織的mRNA(tester和driver),反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用4堿基識別酶(RsaI)或HaeIII酶切兩種cDNA產(chǎn)生平端片段;將testerc DNA分成均等的兩份,分別接上dapter1和adapter2兩種接頭,并與過量的經(jīng)RsaI消化的driver樣本變性后退火雜交。*次雜交后有4種產(chǎn)物:a是單鏈testercDNA;b是自身退火的testercDNA雙鏈;c是tester和driver的異源雙鏈;d是drivercDNA。
根據(jù)復(fù)性動力學(xué)原理,豐度高的單鏈cDNA退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA,因此*次雜交使得豐度有差別的cDNA的單鏈分子的相對含量趨向一致?；旌蟽煞蓦s交樣品,同時加入新的變性driver cDNA 進(jìn)行第二次消減雜交。雜交*后補(bǔ)平末端,加入合適引物(即adapter1和adapter2的部分特異序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,只有含不同接頭的雙鏈DNA分子(e)才可進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的片段。利用adapter上的酶切位點可進(jìn)行克隆、測序等。
二十、蛋白質(zhì)芯片
二十一、Northern blot
二十二、Southern blot