糖基化是一種最常見(jiàn)的蛋白翻譯后修飾，唾液酸作為“橋梁”分子附著在聚糖的遠(yuǎn)端，唾液酸化聚糖表現(xiàn)出廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性，這使他們?cè)诓煌纳^(guò)程中具有豐富的生物學(xué)功能，包括發(fā)育、體細(xì)胞重編輯和癌癥進(jìn)展。
蛋白藥物中，唾液酸對(duì)糖蛋白的穩(wěn)定性和3D構(gòu)象很重要，并且具有關(guān)鍵性的功能作用。重組人促紅細(xì)胞生成素（EPO）廣泛應(yīng)用于治療腎性貧血以及 腫瘤等各種慢性疾病所伴發(fā)的貧血。該藥物 是一種單鏈的酸性糖蛋白，分子量為 32000-39000Dar,EPO 的糖基包括 3 個(gè) N2 糖 鏈（分別位于 Asp 24，Asp 38，Asp 83）和一個(gè) O 糖鏈（位 于 Ser126）。他們的主要成分是甘露糖，巖藻糖和唾液酸等 [1]。其中，唾液酸在維持 EPO 分子的酸性，阻斷細(xì)胞表面半乳糖受 體結(jié)合，防止 EPO 失活等方面有重要作用 [2]。陰離子交換-親水相互作用的混合模式GlycanPac AXH柱子，既能將糖鏈按照唾液酸的數(shù)目進(jìn)行分組，又能根據(jù)糖的羥基結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分離。創(chuàng)新性的解決高唾液酸蛋白糖型分離難題[3] [4]。方案如下：
樣品制備
本次樣品使用PNG酶酶切后，對(duì)比了經(jīng)典的還原酶切和非還原酶切后使用2AB標(biāo)記的N-糖鏈的分離情況，在整個(gè)樣品制備過(guò)程中，過(guò)量的標(biāo)記試劑會(huì)干擾糖鏈，特別是低唾液酸糖鏈的出峰，所以使用了Hypersep Aminopropyl的氨基小柱進(jìn)行凈化處理。該氨基小柱可以高效地除掉過(guò)量的標(biāo)記試劑，得到優(yōu)異的糖型分離結(jié)果。
GlycanPac AXH UHPLC色譜柱VS GlycanPac AXH HPLC色譜柱分析結(jié)果
UHPLC色譜柱更小的粒徑能夠得到更多的組分信息，特別是高唾液酸含量的EPO N糖，如圖（1）和圖（2）所示，圖（3）和圖（4）所示，無(wú)論是非還原酶切和還原酶切的樣品，Glypac AXH 1.9 μm的UHPLC色譜柱能夠?qū)⒔M內(nèi)的N糖分離的更好，遠(yuǎn)超過(guò)HPLC的結(jié)果，兩根柱子都可以將N糖分成5組。
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GlycanPac AXH色譜柱下，非還原酶切VS還原酶切重復(fù)性對(duì)比結(jié)果
在多次平行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如圖（5）和圖（6）所示，發(fā)現(xiàn)非還原酶切的重現(xiàn)性?xún)?yōu)于還原 酶切的重現(xiàn)性。
總 結(jié)
陰離子交換-親水相互作用混合模式的GlycanPac AXH的UHPLC色譜柱，解決了高唾液酸樣品在親水相互作用模式下，分離度不夠，不同個(gè)數(shù)唾液酸修飾的糖鏈定性難題。對(duì)于高唾液酸蛋白分析提供了新的選擇。
更多新的應(yīng)用方案
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引用文獻(xiàn)：
[1] D avis J M , A rakaw a T, Strick land T W , et al. Biochemistry, 1987, 26: 2633—2638
[2] Dongm i C, M yungsoo K, Tongsei A. J. Chromatograph. B, 1996, 687: 189—199
[3] 李響， 中國(guó)新藥雜志，2024，33（6）
[4] GlycanPac AXH-1 Columns Product Manual
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