蛋白質是生命體的基本組成部分，參與了幾乎所有的生命活動，是生命活動的主要承擔者。蛋白質研究對于理解生命本質、疾病診斷和治療、新藥開發(fā)等都具有重要意義。而蛋白質設計在蛋白質研究中扮演著至關重要的角色，它不僅突破了自然進化的限制，允許研究人員創(chuàng)造出具有全新或功能優(yōu)化的蛋白質，還加速了新藥研發(fā)進程，推動工業(yè)酶的優(yōu)化，并為合成生物學的發(fā)展提供了有力支持。
今天小編和大家分享一項今年9月份發(fā)表在《Protein Science》上的研究，作者介紹了CFPS在蛋白質設計中的應用，并探討了其優(yōu)勢、挑戰(zhàn)及未來發(fā)展方向。
一、研究背景
蛋白質設計的目標是創(chuàng)建具有特定功能的蛋白質，目前，基于物理的方法雖然能夠提供詳細的結構信息，但成功率相對較低。相比之下，基于機器學習的方法顯著提高了設計的成功率，但設計失敗的情況仍然普遍。而且，無論采用哪種方法，最終都需要通過實驗來驗證設計的蛋白質是否具有預期的功能。當前主要的挑戰(zhàn)是從數十到數百個設計中篩選出那些具有預期功能的蛋白質，并且要明確設計失敗的原因，包括表達和可溶性問題以及未能形成正確的結構和功能的原因。因此，尋找一種高效、便捷的方法來篩選和驗證蛋白質設計顯得尤為重要。
二、無細胞蛋白合成在蛋白質設計中的應用
無細胞蛋白合成（CFPS）提供了一種更為簡單的方法來識別功能性設計，并能解釋設計為何未能如預期般表現。CFPS相比在傳統生產重組蛋白的方法具有多個優(yōu)勢，如不受宿主細胞存活限制、可生產細胞毒性蛋白、反應僅由目標DNA編程、條件易于調整、適合小體積篩選且成本低。此外，CFPS更便于生產制造和測試設計蛋白的功能，并探索設計失敗的原因，從而可以提供豐富的數據集以優(yōu)化后續(xù)設計等。
圖1:表示功能性蛋白質設計的識別的示意圖
三、活性篩選
在蛋白質設計中，篩選活性是關鍵步驟之一。CFPS作為一種高效且靈活的方法，在這一過程中發(fā)揮了重要作用，它可以快速評估蛋白質的活性，同時還能幫助識別設計失敗的原因。此外，CFPS可以在微孔板或微流控設備中進行，反應體積小，適合大規(guī)模篩選。例如，通過熒光或比色法可以直接檢測酶活性，而無需復雜的純化步驟。CFPS還可以用于高通量篩選，例如Rapp等人通過機器人自動化系統結合CFPS來探索蛋白質的熱穩(wěn)定性和活性。這種方法不僅提高了篩選效率，還能夠在短時間內排除無效的設計。從而快速篩選出功能性蛋白質，還能為設計失敗提供寶貴的信息，從而指導后續(xù)的設計改進，例如，de los Santos等人通過CFPS篩選出具有特定DNA結合活性的轉錄抑制因子突變體，Rolf等人通過優(yōu)化反應條件提高酶的可溶性產量?？傊?，CFPS是一種簡單、信息豐富且易于操作的技術，非常適合用于蛋白質設計和驗證流程。
圖2:使用CFPS評估蛋白質功能的案例
四、表面捕獲的CFPS產生的蛋白質
蛋白質表面捕獲是評估蛋白質功能的重要手段。通過將蛋白質產品固定到固體表面上，可以將其與CFPS試劑分離，從而通過清洗表面實現這一目的。這使得可以在不同條件下測試蛋白質活性，如pH值、溫度、緩沖液成分以及對不同底物的反應性。并且可以測試每個突變體在多種條件下的表現。如，PISA（Protein In Situ Array）技術通過鎳涂層表面捕獲帶有His標簽的蛋白質，實現高通量功能檢測。最近，Thornton將自組裝蛋白質表面用于共價捕獲無細胞合成的蛋白質。具體來說，可通過His標簽蛋白、生物素化的DNA、BslA-SpyTag 形成自組裝蛋白質單層等策略來實現表面補獲。這些方法不僅能夠高效地捕獲蛋白質，還能夠在不同的實驗條件下進行蛋白質功能的測試，從而為蛋白質設計和功能研究提供了強大的工具。
圖3:CFPS的表面捕獲策略示例
五、CFPS用于識別設計失敗的原因
當前蛋白質設計可能因多種原因而“失敗"，不僅僅是未能實現預期的結構和功能。而CFPS能夠幫助識別導致設計失敗的原因，包括轉錄、翻譯、聚集和錯誤折疊等問題。例如通過添加染料結合適配體序列測試轉錄，通過融合熒光蛋白或四半胱氨酸迷你螺旋標簽測試翻譯，通過熒光賴氨酸殘基或放射性氨基酸測試溶解度，通過高通量蛋白酶切試驗評估蛋白質折疊。
通過這些方法收集的實驗數據可以幫助區(qū)分設計失敗的不同原因，從而利用數據驅動的方法識別可能導致失敗的設計蛋白質的特性，并將這些結果納入未來的蛋白質設計算法中。這不僅有助于提高設計成功率，還能為蛋白質設計領域提供寶貴的反饋信息。
圖4:CFPS來識別蛋白質設計可能的失敗點
六、結論
CFPS作為一種快速、靈活且多功能的技術，相對于傳統表達方法的優(yōu)勢顯著，適合用作多種蛋白質設計項目的中介篩選工具，無細胞系統能夠實施各種功能檢測，這使得研究人員可以輕松評估不同設計的功能（而不僅僅是結構）。通過結合計算設計（機器學習等）和高通量篩選，CFPS不僅提高了蛋白質設計的成功率，還加速了新功能蛋白的發(fā)現和應用。在中等通量水平下，CFPS為研究人員提供了一種可行的技術，可以并行測試多種蛋白質設計的功能。因此，可以預見CFPS將在未來成為促進蛋白質設計的更加重要的工具。
蘇州珀羅汀生物作為一家專業(yè)的無細胞蛋白表達生物技術公司，擁有國家高層次人才、海歸博士等人才組成的專業(yè)技術團隊，以自主研發(fā)、特色的無細胞蛋白表達技術平臺為依托，專業(yè)從事多肽、重組蛋白、基因工程抗體、重組疫苗以及大分子蛋白藥物的研究和開發(fā)，同時為廣大生物醫(yī)藥企業(yè)和研究機構提供無細胞蛋白表達產品、蛋白原料試劑及定制化服務。
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