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細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)
1、范圍：適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。
2 定義
2.1 回復(fù)突變 reverse mutation
細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。
2.2 基因突變 gene mutation
在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。
2.3 堿基置換突變 base substitution mutation
引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。
堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。
轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。
顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。
2.4 移碼突變 frameshift mutation
引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。
2.5 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)bacterial reverse mutation assay
利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型→原養(yǎng)型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。
2.6 S9
經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或C12H12N2O3鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。
3 原理
鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長；大腸桿菌色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。
某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。
4 儀器和設(shè)備
電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱（－80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿、生物安全柜等。
5 培養(yǎng)基和試劑
5.1 0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液
成分： | L-組氨酸（MW155） | 78mg |
| D-生物素（MW244） | 122mg |
| L-色氨酸（MW204） | 102mg |
| 加蒸餾水/去離子水至 | 1000mL |
配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。
5.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基
成分： | 瓊脂粉 | 1.2g |
| 氯化鈉 | 1.0g |
| 加蒸餾水/去離子水至 | 200mL |
配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實(shí)驗(yàn)時，加入0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液20mL。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。
5.3 Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E
成分： | 枸櫞酸(C6H8O7·H2O) | 100g |
| 磷酸氫二鉀(K2HPO4) | 500g |
| 磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) | 175g |
| 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) | 10g |
| 加蒸餾水/去離子水至 | 1000mL |
配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
5.4 20%葡萄糖溶液
成分： | 葡萄糖 | 200g |
| 加蒸餾水/去離子水至 | 1000mL |
配制：加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。
5.5 底層瓊脂培養(yǎng)基
成分： | 瓊脂粉 | 7.5g |
| 蒸餾水/去離子水 | 480mL |
| V-B培養(yǎng)基E | 10mL |
| 20%葡萄糖溶液 | 10mL |
配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中24h，備用。
5.6 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
成分： | :C8H9Cl | 2.5g |
| 胰胨 | 5.0g |
| 磷酸氫二鉀(K2HPO4) | 1.0g |
| 加蒸餾水/去離子水至 | 500mL |
配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
5.7 鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)
成分： | (KCl) | 61.5g |
KCl | 氯化鎂(MgCl2·6H2O) | 40.7g |
| 加蒸餾水/去離子水至 | 500mL |
配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
5.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)
成分： | 磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) | 2.965g |
| 磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) | 29.015g |
| 加蒸餾水/去離子水至 | 500mL |
配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
5.9 S9混合液
成分： | 每毫升S9混合液 | |
| 肝S9 | 100μl |
| 鹽溶液 | 20μl |
| 滅菌蒸餾水/去離子水 | 380μl |
| 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 | 500μl |
| 輔酶II(NADP) | 4μmol |
| 6-磷酸葡萄糖(G-6-P) | 5μmol |
配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。
5.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑
5.10.1 組氨酸-色氨酸-生物素平板
成分： | 瓊脂粉 | 15g |
| 蒸餾水/去離子水 | 934mL |
| (V-B)培養(yǎng)基E | 20mL |
| 20%葡萄糖 | 20mL |
| 滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) | 10mL |
| 滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) | 10mL |
| 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 | 6mL |
配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基、組氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水/去離子水改為944mL）。待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。
5.10.2 氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板
成分： | 瓊脂粉 | 15g |
| 蒸餾水/去離子水 | 930mL |
| (V-B)鹽溶液 | 20mL |
| 20%葡萄糖 | 20mL |
| 滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL） | 10mL |
| 滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) | 10mL |
| 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 | 6mL |
| 氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/L NaOH中) | 3.15mL |
| 四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) | 0.25mL |
配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中，混勻（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水/去離子水改為加940mL）。冷卻至大約50℃，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。
應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。
5.10.3 營養(yǎng)瓊脂平板
成分： | 瓊脂粉 | 7.5g |
| 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 | 500mL |
配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。
6 試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定
6.1 試驗(yàn)菌株
采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合：
鼠傷寒沙門氏菌TA1535；
鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537；
鼠傷寒沙門氏菌TA98；
鼠傷寒沙門氏菌TA100；
鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）；
6.2 生物學(xué)特性鑒定
新獲得的或長期保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。
表1 試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)
菌株 | 組氨酸缺陷 | 色氨酸缺陷 | 脂多糖屏障缺損 | 氨芐青霉素抗性 | 切除修復(fù)缺損 | 四環(huán)素 抗性 | 自發(fā)回變菌落參考數(shù)* | |
Ames實(shí)驗(yàn)室 | Zeiger實(shí)驗(yàn)室 | |||||||
TA97 | + | / | + | + | + | - | 90~180* | 75~200* |
TA97a | + | / | + | + | + | - | 90~180* | 75~200* |
TA98 | + | / | + | + | + | - | 30~50 | 20~50 |
TA100 | + | / | + | + | + | - | 100~200 | 75~200 |
TA102 | + | / | + | + | - | + | 240~320* | 100~400* |
TA1535 | + | / | + | - | + | - | 10~35 | 5~20 |
TA1537 | + | / | + | - | + | - | 3~15 | 5~20 |
WP2uvrA | / | + | / | - | + | - | / | 5~20 |
WP2uvrA（pKM101） | / | + | / | + | + | - | / | 100~200 |
注 | “+”表示需要組氨酸 | “+”表示需要色氨酸 | “+”表示具有rfa突變 | “+”表示具有R因子 | “+”表示對于鼠傷寒沙門氏菌具有△uvrB突變，對于大腸桿菌，具有△uvrA突變 | “+”表示具有pAQ1質(zhì)粒 | *在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌 落數(shù)略增。 對于各菌的自發(fā)回變范圍，各個實(shí)驗(yàn)室在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對照數(shù)據(jù)庫，形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范圍。同時，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與文獻(xiàn)報(bào)道相符。 | |
6.2.1 組氨酸缺陷/色氨酸缺陷
原理：組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成組氨酸，只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。
色氨酸缺陷試驗(yàn)菌株本身不能合成色氨酸，只能在補(bǔ)充色氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。
鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸或者色氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生長，而在無色氨酸平板上則不能生長。
6.2.2 脂多糖屏障缺損
原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì),如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。
6.2.3 氨芐青霉素抗性
原理：含R因子的試驗(yàn)菌株對氨芐青霉素有抗性。因?yàn)镽因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。
6.2.4 紫外線敏感性
原理：具有△uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，當(dāng)受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：具有△uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長，而具有完整地切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常生長。
6.2.5 四環(huán)素抗性
原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質(zhì)粒。
6.2.6 自發(fā)回變
原理：每種試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性。
鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸-色氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中孵育48—72h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。
6.2.7 回變特性-診斷性試驗(yàn)
原理：每種試驗(yàn)菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應(yīng)不一。
鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。將受試物換成診斷性誘變劑。
結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對某些診斷性誘變劑*的回變結(jié)果參見表2。
表2 測試菌株的回變性
誘變劑 | 劑量(μg/皿) | S9 | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 | TA1535 | TA1537 | WP2uvrA | WP2uvrA（pKM101） |
柔毛霉素 | 6.0 | - | 124 | 3123 | 47 | 592 | / | / | / | / |
N3Na | 1.5 | - | 76 | 3 | 3000 | 188 | 320(0.5μg) | / | / | / |
ICR-191 | 1.0 | - | 1640 | 63 | 185 | 0 | / | / | / | / |
鏈霉黑素 | 0.25 | - | inh | inh | inh | 2230 | / | / | / | / |
MitomycinC | 0.5 | - | inh | inh | inh | 2772 | / | / | / | / |
2,4,7-三硝基-9-芴酮 | 0.20 | - | 8377 | 8244 | 400 | 16 | / | / | / | / |
4-硝基-O-次苯二胺 | 20 | - | 2160 | 1599 | 798 | 0 | / | / | / | / |
4-硝基喹啉-N-氧化物 | 0.5 | - | 528 | 292 | 4220 | 287 | / | / | 610 | / |
甲基磺酸甲酯 | 1.0(μl) | - | 174 | 23 | 2730 | 6586 | / | / | / | / |
C8H10N3NaO3S | 50.0 | - | 2688 | 1198 | 183 | 895 | / | / | / | / |
9-氨基吖啶 | 50 | - | / | / | / | / | / | 337 | / | / |
2-氨基芴 | 10 | + | 1742 | 6194 | 3026 | 261 | / | / | / | / |
苯并（a）芘 | 1.0 | + | 337 | 143 | 937 | 255 | / | 110(5μg) | / | / |
2-氨基蒽 | 20 | + | / | / | / | / | 380(5μg) | / | 300 | / |
注：inh表示抑菌。
7 大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備
7.1 誘導(dǎo)
選擇健康雄性成年大鼠，體重200g左右。將多氯聯(lián)苯（PCB混合物）溶于玉米油中，濃度為200mg/mL，按500mg/kg體重一次腹腔注射，5d后處死動物，處死前禁食12h。
也可采用C12H12N2O3鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備。經(jīng)口或腹腔注射給予80mg/kgC12H12N2O3鈉和80mg/kg β-萘黃酮，連續(xù)3天，處死前禁食16h。
7.2 S9制備
首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/LKCl溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/LKCl溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/LKCl溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝2mL—3mL。儲存于液氮生物容器中或－80℃冰箱中備用。
上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進(jìn)行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。
8 溶劑的選擇
如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水/去離子水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對試驗(yàn)菌株毒性低且無致突變性的有機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100μl。
9 劑量的設(shè)計(jì)
決定受試物MAX高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。
對原料而言，一般MAX高劑量組可為5mg/皿或5µl/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，MAX高劑量可為MAX低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，MAX高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。
10 試驗(yàn)操作步驟
10.1 增菌培養(yǎng)
取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1-2×109活菌數(shù)。
10.2 平板摻入法
實(shí)驗(yàn)時，將含0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸）的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和磷酸鹽緩沖液0.5mL或者S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48—72h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
實(shí)驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時設(shè)空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。
11 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
如果受試物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該受試物判定為致突變陽性，
（1）呈劑量-反應(yīng)關(guān)系
（2）任何一個劑量條件下，出現(xiàn)陽性反應(yīng)并有可重復(fù)性
受試物經(jīng)上述五個試驗(yàn)菌株測定后，只要有一個試驗(yàn)菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報(bào)告該受試物細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)為致突變陽性。如果受試物經(jīng)五個試驗(yàn)菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。