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杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
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賽默飛熒光定量PCR儀使用方法
賽默飛熒光定量PCR儀（如 QuantStudio 系列、ABI 7500 系列）廣泛用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)、基因分型等實(shí)驗(yàn)。以下是熒光定量PCR儀的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，幫助您完成實(shí)驗(yàn)。
1. 儀器操作前的準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
確定實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：
基因表達(dá)定量、病原體檢測(cè)、SNP分析等。
選擇合適的試劑體系：
使用 TaqMan 探針、SYBR Green 染料或其他符合實(shí)驗(yàn)需求的反應(yīng)體系。
實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
樣本模板（如 DNA、RNA 經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄的 cDNA）。
引物和探針（設(shè)計(jì)特異性高的引物和探針）。
PCR 反應(yīng)試劑（如 Taq 酶、dNTPs）。
PCR 反應(yīng)板（96孔或384孔，依儀器型號(hào)選擇）或 PCR 管。
無(wú)菌操作工具（如移液器、濾芯吸頭）。
檢查儀器狀態(tài)
確保熒光定量PCR儀已正確連接電源并開(kāi)機(jī)。
檢查儀器是否校準(zhǔn)，包括光學(xué)通道和溫控模塊。
清潔樣本托盤(pán)，避免污染。
2. 樣本和反應(yīng)混合物的制備
標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系（以 20 µL 反應(yīng)體系為例）：
| 成分 | 體積（µL） | 說(shuō)明 |
|---|---|---|
| 樣本模板 | 1-2 | 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整濃度和體積 |
| 引物對(duì)（10 µM） | 0.4-1.0 | 每對(duì)引物（正向和反向） |
| 探針或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探針或 SYBR Green 染料 |
| PCR 反應(yīng)緩沖液 | 10 | 含 Mg2?、dNTPs 等 |
| Taq DNA 聚合酶 | 0.5 | 熱穩(wěn)定酶，支持實(shí)時(shí)擴(kuò)增 |
| 無(wú)核酸酶水 | 調(diào)至總量 20 µL | 確保反應(yīng)體系最終體積正確 |
步驟：
在無(wú)菌環(huán)境下混合所有反應(yīng)成分，輕輕振蕩均勻，避免氣泡產(chǎn)生。
將混合好的反應(yīng)液分裝至 96 孔 PCR 板或 0.2 mL PCR 管中。
在每個(gè)孔/管上覆蓋光學(xué)透明封板或封膜，防止蒸發(fā)。
確保每孔的體積一致，以避免離心過(guò)程中不平衡。
3. 熒光定量PCR儀操作步驟
1. 啟動(dòng)儀器
按儀器型號(hào)啟動(dòng)，如 QuantStudio 系列或 ABI 7500 系列。
打開(kāi)儀器配套軟件（如 QuantStudio Design and Analysis 軟件）。
2. 設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)
選擇實(shí)驗(yàn)類型：
絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)樣本中靶基因的絕對(duì)拷貝數(shù)。
相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)：研究靶基因在不同樣本中的表達(dá)水平。
溶解曲線分析：用于區(qū)分特異性擴(kuò)增和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
輸入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
輸入靶基因和對(duì)照基因的信息。
熒光染料/探針類型（如 FAM、SYBR Green）。
選擇樣本板格式：
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇 96 孔板或 384 孔板。
設(shè)置每個(gè)孔的樣本名稱、反應(yīng)成分和靶標(biāo)信息。
設(shè)置 PCR 程序：
初始變性： 95°C，2 分鐘。
循環(huán)反應(yīng)：
95°C，15 秒（變性）。
60°C，30-60 秒（退火和延伸），共 40-45 個(gè)循環(huán)。
標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)程序：
如果是溶解曲線分析，加入升溫梯度（如從 60°C 升至 95°C）。
3. 加載樣本板
將已封裝好的 PCR 板或 PCR 管放入儀器樣本托盤(pán)。
確保板的擺放位置正確，并關(guān)閉樣本艙門(mén)。
4. 啟動(dòng)運(yùn)行
點(diǎn)擊軟件中的 "運(yùn)行" 按鈕，啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)程序。
儀器開(kāi)始熱循環(huán)過(guò)程，同時(shí)采集熒光信號(hào)。
4. 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果處理
1. 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)
儀器運(yùn)行期間，可實(shí)時(shí)觀察熒光信號(hào)累積曲線，監(jiān)控樣本擴(kuò)增狀態(tài)。
2. 結(jié)果分析
擴(kuò)增曲線：分析每個(gè)樣本的熒光信號(hào)累積曲線，判斷 Ct 值（循環(huán)閾值）。
Ct 值分析：
定量分析靶標(biāo)的表達(dá)水平。
樣本濃度越高，Ct 值越低。
溶解曲線（SYBR Green 實(shí)驗(yàn)）：判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)）：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度。
3. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出
實(shí)驗(yàn)完成后，通過(guò)軟件導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（如擴(kuò)增曲線圖、Ct 值表）。
數(shù)據(jù)可保存為 Excel、PDF 或其他格式，方便后續(xù)分析。
5. 儀器清潔與維護(hù)
樣本艙清潔：
每次實(shí)驗(yàn)后，用無(wú)塵布輕輕擦拭樣本托盤(pán)，去除可能的污染物。
定期清潔光學(xué)模塊（如說(shuō)明書(shū)所示），確保熒光檢測(cè)靈敏度。
軟件維護(hù)：
定期更新儀器和軟件至最新版本，獲取最新功能和性能優(yōu)化。
校準(zhǔn)與檢測(cè)：
定期校準(zhǔn)儀器光學(xué)系統(tǒng)和溫控模塊，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
如果儀器長(zhǎng)期未使用，建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行性能驗(yàn)證。
安全存儲(chǔ)：
關(guān)閉儀器電源，保持設(shè)備干燥。
防止樣本托盤(pán)接觸過(guò)高濕度或灰塵。
注意事項(xiàng)
樣本準(zhǔn)備階段：
嚴(yán)格避免交叉污染。
使用無(wú) RNA 酶、無(wú) DNA 酶的耗材。
模板樣本濃度適中，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致抑制擴(kuò)增。
反應(yīng)體系配置：
所有操作在冰上進(jìn)行，防止酶降解。
確保所有反應(yīng)組分混合均勻。
實(shí)驗(yàn)運(yùn)行階段：
不要隨意中斷儀器運(yùn)行，避免影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定，避免震動(dòng)或電力波動(dòng)。
總結(jié)
賽默飛熒光定量PCR儀的使用主要包括 樣本準(zhǔn)備、反應(yīng)體系配置、儀器參數(shù)設(shè)置、運(yùn)行程序以及數(shù)據(jù)分析 等五個(gè)核心環(huán)節(jié)。嚴(yán)格按照操作規(guī)范可以有效提高實(shí)驗(yàn)的成功率和數(shù)據(jù)的可靠性。實(shí)驗(yàn)完成后，定期維護(hù)儀器可確保其長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。
