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杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
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賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀操作規(guī)程
以下是 賽默飛 QuantStudio Q5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。此規(guī)程涵蓋實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、儀器操作、實(shí)驗(yàn)設(shè)置、運(yùn)行和數(shù)據(jù)分析的步驟。
1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1.1 儀器檢查
確保儀器接通電源并處于正常工作狀態(tài)。
打開(kāi) QuantStudio Q5 儀器和配套的軟件系統(tǒng)。
檢查儀器光學(xué)模塊是否清潔，無(wú)塵無(wú)污染。
確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定（溫度20-25°C，濕度40-60%），避免灰塵干擾。
1.2 反應(yīng)材料準(zhǔn)備
準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)所需試劑和耗材：
樣本模板（DNA 或 RNA 轉(zhuǎn)錄的 cDNA）。
引物和探針（根據(jù)靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)）。
熒光定量PCR試劑（如SYBR Green Master Mix或TaqMan Master Mix）。
96 孔板或 0.2 mL PCR 管，以及光學(xué)透明封板或封膜。
無(wú)菌移液器、濾芯吸頭。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系
以下是 20 µL 體系的標(biāo)準(zhǔn)配方示例：
| 成分 | 體積（µL） | 說(shuō)明 |
|---|---|---|
| PCR Master Mix | 10 | 含有聚合酶、dNTP、Mg2?等 |
| 上下游引物（10 µM） | 0.5 各 | 根據(jù)靶基因調(diào)整濃度 |
| 探針（10 µM）或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探針或 SYBR Green |
| 模板 DNA/cDNA | 1-2 | 根據(jù)樣本濃度調(diào)整體積 |
| 無(wú)核酸酶水 | 至 20 µL | 補(bǔ)足總反應(yīng)體系體積 |
1.4 注意事項(xiàng)
反應(yīng)體系混合時(shí)保持在冰上操作。
混勻后輕微離心，避免產(chǎn)生氣泡。
使用負(fù)對(duì)照（無(wú)模板對(duì)照）和正對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)的可靠性。
2. 儀器操作步驟
2.1 啟動(dòng)儀器
打開(kāi) QuantStudio Q5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
啟動(dòng)配套軟件（QuantStudio Design and Analysis Software）。
選擇“新建實(shí)驗(yàn)"以創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)文件。
2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置
實(shí)驗(yàn)類(lèi)型選擇：
絕對(duì)定量：用于計(jì)算 DNA 或 RNA 的絕對(duì)拷貝數(shù)。
相對(duì)定量：用于基因表達(dá)水平比較。
溶解曲線(xiàn)分析：檢查 PCR 產(chǎn)物的特異性。
基因分型：分析基因突變和 SNP。
板型設(shè)置：
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇 96 孔或 384 孔板格式。
為每個(gè)孔輸入樣本名稱(chēng)（如標(biāo)準(zhǔn)品、未知樣本、對(duì)照組）。
熒光染料設(shè)置：
根據(jù)使用的染料或探針設(shè)置相應(yīng)的熒光通道（如 FAM、VIC、ROX）。
啟用 ROX 參考染料（如果試劑中包含）。
熱循環(huán)程序：
初始變性：95°C，2-10 分鐘。
循環(huán)反應(yīng)（40 次循環(huán)）：
95°C，15 秒（變性）。
60°C，30-60 秒（退火和延伸，熒光信號(hào)采集階段）。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) PCR 循環(huán)程序：
如果需要溶解曲線(xiàn)分析，加入升溫梯度（如從 60°C 至 95°C）。
2.3 加載樣本板
將已封裝好的 PCR 板或管放入樣本托盤(pán)。
確保 PCR 板放置平穩(wěn)，并封膜牢固，避免蒸發(fā)。
關(guān)閉樣本艙門(mén)，確保儀器密封。
2.4 啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)
檢查設(shè)置無(wú)誤后，點(diǎn)擊 “運(yùn)行實(shí)驗(yàn)"。
儀器開(kāi)始運(yùn)行，同時(shí)采集熒光信號(hào)。
在運(yùn)行過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增曲線(xiàn)以確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)正常。
3. 數(shù)據(jù)分析
3.1 實(shí)時(shí)監(jiān)控
儀器運(yùn)行時(shí)，軟件界面會(huì)顯示擴(kuò)增曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)變化。
檢查所有樣本的熒光信號(hào)是否正常累積。
3.2 Ct 值分析
Ct 值（循環(huán)閾值）： 自動(dòng)計(jì)算每個(gè)樣本的 Ct 值，Ct 值越低，樣本初始濃度越高。
對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用于絕對(duì)定量計(jì)算樣本濃度。
3.3 溶解曲線(xiàn)分析（SYBR Green 實(shí)驗(yàn)）
檢查 PCR 產(chǎn)物是否特異性擴(kuò)增。
特異性擴(kuò)增應(yīng)顯示單一峰值，非特異性產(chǎn)物會(huì)有多個(gè)峰值。
3.4 數(shù)據(jù)導(dǎo)出
將分析結(jié)果（擴(kuò)增曲線(xiàn)、Ct 值表、溶解曲線(xiàn)等）保存為 Excel、PDF 或圖片格式。
確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)備份并存檔。
4. 實(shí)驗(yàn)完成后的維護(hù)
4.1 清潔儀器
實(shí)驗(yàn)完成后，取出樣本板并清理托盤(pán)。
用無(wú)塵布輕輕擦拭儀器內(nèi)部，防止樣本殘留。
4.2 光學(xué)模塊維護(hù)
定期清潔光學(xué)模塊，保持熒光檢測(cè)的靈敏度。
如果出現(xiàn)熒光信號(hào)異常，需校準(zhǔn)光學(xué)模塊。
4.3 溫控校準(zhǔn)
按照儀器使用手冊(cè)，每 3-6 個(gè)月對(duì)溫控模塊進(jìn)行校準(zhǔn)，確保溫度一致性。
4.4 軟件更新
定期檢查軟件版本，安裝賽默飛發(fā)布的最新補(bǔ)丁或更新。
5. 注意事項(xiàng)
樣本操作
使用無(wú)核酸酶污染的耗材和移液器。
避免模板 DNA 交叉污染。
試劑保存
熒光染料和酶類(lèi)應(yīng)按照試劑說(shuō)明存放（如 -20°C 冷凍）。
使用前確保試劑混勻。
實(shí)驗(yàn)運(yùn)行
在運(yùn)行過(guò)程中不要隨意中斷儀器運(yùn)行，防止數(shù)據(jù)丟失。
若出現(xiàn)異常終止，記錄故障代碼并聯(lián)系賽默飛技術(shù)支持。
總結(jié)
賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀以其靈活性和高精度著稱(chēng)，是中小型實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展基因定量分析的理想工具。嚴(yán)格按照操作規(guī)程（SOP）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，同時(shí)確保儀器的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。
