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實現(xiàn)本應(yīng)用自動化的三大理由

哺乳動物體外細胞培養(yǎng)物的可用性是藥物發(fā)現(xiàn)的一個關(guān)鍵瓶頸。為了將哺乳動物細胞作為基于細胞的高通量測試的資源，必須克服人工細胞繁殖缺乏標準化、重復(fù)性差和通量不足的問題。

• 提供大量培養(yǎng)細胞。

• 確?？芍貜?fù)性和過程安全性。

• 標準化哺乳動物細胞增殖。

簡介

在藥物篩選和細胞生物學(xué)研究中對哺乳動物細胞的需求不斷增加。在高通量篩選中，候選藥物的評估基于其對細胞培養(yǎng)的生物效應(yīng)，在基于細胞的ADME-T測定中測試新化合物的代謝行為和毒性?；A(chǔ)研究依賴于大量的細胞系和原代細胞，它們構(gòu)成了闡明細胞增殖、分化和功能的基本機制的工具。在這個領(lǐng)域，胚胎干細胞作為一個模型系統(tǒng)越來越重要。這些細胞除了具有巨大的分化潛能外，還具有無限自我更新的能力，這有助于它們進行有效的基因修飾。目前使用的細胞培養(yǎng)方法的局限性包括缺乏標準化與重復(fù)性差和通量不足。由此可見，細胞的可用性會成為實驗全流程的瓶頸。HAMILTON和Life&Brain結(jié)合了他們在原代細胞、細胞系和胚胎干細胞自動培養(yǎng)系統(tǒng)開發(fā)方面的專業(yè)知識，該系統(tǒng)可大量提供高質(zhì)量的細胞。

方法描述

該系統(tǒng)的典型流程包括：

• 預(yù)定運行期間細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基的更換

• 胰蛋白酶化后細胞培養(yǎng)物的收集

• 在培養(yǎng)孔內(nèi)均勻地接種細胞

• 向細胞培養(yǎng)物中添加生長因子或藥理活性物質(zhì)

通常培養(yǎng)基更換在隔夜運行中進行，如下所示：

• 通過工作列表選擇感興趣的微孔板

• 計算容器中的適量培養(yǎng)基，并從冷培養(yǎng)箱中獲?。蝗缓髮⑴囵B(yǎng)基容器轉(zhuǎn)移至加熱位置

• 將第一個板從溫培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到移液工作站，并去除殘留的培養(yǎng)基

• 使用一次性吸頭或可洗鋼針更換培養(yǎng)基

• 將微孔板轉(zhuǎn)移回培養(yǎng)箱中

手動溫和處理 - 轉(zhuǎn)移至自動化流程

Hamilton的液體處理技術(shù)可以模擬典型的手動操作，例如板混勻或溫和移液。本品非常適合處理脆弱的哺乳動物貼壁細胞，如胚胎干細胞。

技術(shù)

Hamilton“無管” 技術(shù): Hamilton 監(jiān)測空氣置換（MAD）移液技術(shù)消除了管、泵或系統(tǒng)液體的使用，從而顯著降低了細菌生長造成污染的風(fēng)險。

接種

這采用Cellhost系統(tǒng)接種可使小鼠胚胎干細胞均勻分布在飼養(yǎng)細胞層上。在胚胎干細胞的情況下，細胞的均勻分布尤為重要，因為細胞團塊的形成導(dǎo)致不受控制的分化。為了達到這一結(jié)果，用機械手模擬在微孔板上分配細胞的典型手動動作。套系統(tǒng)主要由8通道的Microlab   STARlet液體處理工作站構(gòu)成，手動裝載吸頭、試劑、濾膜板和PCR板的載架，真空抽濾系統(tǒng)整合在工作站的臺面上。在操作過程中，通過CO-RE抓手來移動微孔板、裝載及拆卸抽濾板架。

培養(yǎng)基更換

細胞培養(yǎng)中最常見的流程是培養(yǎng)基的更換。為了最大限度地減少殘留量，在一側(cè)升高細胞培養(yǎng)板（圖2），并在孔的底端小心吸出培養(yǎng)基。在孔邊緣緩慢加入新培養(yǎng)基，從而避免干擾細胞層。顯微鏡研究顯示細胞層的完整性（圖3a）-與不太謹慎的手動實驗形成鮮明對比（圖3b）。

系統(tǒng)描述

Cellhost系統(tǒng)的核心是配備內(nèi)部機械手iSWAP的Microlab STAR移液工作站。其在平臺上處理SBS標準細胞培養(yǎng)板。兩個Kendro培養(yǎng)箱整合到系統(tǒng)中（圖1）。系統(tǒng)的模塊化架構(gòu)允許將附加組件整合到臺面上，例如成像系統(tǒng)。

應(yīng)用軟件

該系統(tǒng)由標準PC和Hamilton開放靈活的Microlab Venus軟件控制，用于過程控制和第三方組件整合。任何設(shè)計用于處理大量板的自動化系統(tǒng)，每個板都經(jīng)歷復(fù)雜的操作且需具備數(shù)據(jù)跟蹤能力。Hamilton Celltask軟件可輕松安排重復(fù)過程，使細胞培養(yǎng)自動化操作非常簡便（圖4）。Celltrack軟件監(jiān)測并跟蹤每個板上的每個操作，并根據(jù)CFR 21第11部分的要求進行數(shù)據(jù)文件記錄。

系統(tǒng)的生物驗證

根據(jù)GLP，使用胚胎干細胞（最敏感的細胞培養(yǎng)范例之一）驗證了Cellhost系統(tǒng)。已經(jīng)明確驗證了生物可行性：

•  移液（接種、收集）后細胞的活力

•  更換培養(yǎng)基后細胞層完整

•  接種后細胞在孔中的均勻分布

•  使用可清洗鋼針時無交叉污染

結(jié)果

用Cellhost培養(yǎng)的胚胎干細胞在接種和更換培養(yǎng)基后保留其典型形態(tài)（圖5）。自發(fā)分化的程度不超過在人工處理的培養(yǎng)物中觀察到的程度。通過堿性磷酸酶活性的組織化學(xué)檢測來驗證多能狀態(tài)的維持。培養(yǎng)48小時后的細胞活力與手動對照實驗中測定的相當。未檢出污染。

通量和容量

6孔板2ml培養(yǎng)基的處理時間：

•  培養(yǎng)基更換：340s

•  細胞收集：1500s

•  滋養(yǎng)細胞制備：520s

•  胚胎干細胞（ESC）板的制備：940s

•  細胞培養(yǎng)箱可擴展至容納1000個96孔板

討論

這項研究的結(jié)果表明了胚胎干細胞培養(yǎng)自動化的可行性。此處使用的系統(tǒng)優(yōu)點是基于手動方法并且不需要液體補充模塊。細胞在各種移液步驟中容易存活，如機械接種和反復(fù)更換培養(yǎng)基。顯微鏡觀察顯示，胚胎干細胞的典型形態(tài)得以保留。此外，與手動對照相比，未觀察到自發(fā)分化增加-這明確表明Cellhost溫和處理細胞。該系統(tǒng)以無污染的方式運行?？梢灶A(yù)期，為胚胎干細胞精細培養(yǎng)而開發(fā)的過程可以轉(zhuǎn)化為毒理學(xué)試驗和藥物篩選中常用的不太敏感的細胞類型。為進一步自動化細胞系（如CaCo2）和下游應(yīng)用（如報告基因分析）掃清了道路。隨著細胞培養(yǎng)的自動化，制藥和生物技術(shù)公司的人工工作量大大減少。