諾博萊德 RIPA裂解液(中)   樣本裂解

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液（中）(RIPA Lysis Buffer)是采用一種經(jīng)典的細(xì)胞組織快速裂解并獲得總蛋白的裂解液，其裂解強(qiáng)度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(弱)。所獲得的蛋白質(zhì)可用于Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)等。

Medium RIPA Lysis Buffer主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

產(chǎn)品組成：

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1.取Medium RIPA Lysis Buffer置室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

2.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS、NS或無(wú)血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3.按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Medium RIPA Lysis Buffer 。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解15～30min，通常裂解液作用于細(xì)胞1～3秒內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。通常6孔板每4.孔細(xì)胞加入100μl解液已經(jīng)足夠，如果細(xì)胞密度很高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。

5.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

6.進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1.取Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

2.低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

3.用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Medium RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～4.250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。

5.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

6.進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

1.取Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

2.把組zhi剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。

3.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過(guò)程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

4.按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。

5.步驟3、4亦可以采用如下過(guò)程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的Medium RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過(guò)程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

6.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

7.進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項(xiàng)：

1.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不用清洗。

2.如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3.如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50～100萬(wàn)細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。

4.如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer時(shí)，應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間，避免有效成分失效。

6.裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，7.則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-KB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。

8.細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行。

有效期： 12個(gè)月有效。

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