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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T / 100T |
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貨號 | D9928 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè),制藥 |
主要用途 | 可直接用于細胞轉染等要求較高的實驗 |
去內毒素質粒小量提取試劑盒
NobleRyderD9928 去內毒素質粒小量提取試劑盒 Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit
產品貨號:D9928
產品名稱:去內毒素質粒小量提取試劑盒 Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit
英文名稱:Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit
產品規(guī)格:50T/100T
去內毒素質粒小量提取試劑盒-常備現(xiàn)貨
產品簡介:
儲存條件:酶附件-20℃,內毒素清除劑4℃,其它試劑RT,復檢期1年
NobleRyderD9928 去內毒素質粒小量提取試劑盒本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞,根據離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結合溶液中的DNA的原理特異性提取質粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附DNA,可最大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。 NobleRyder公司研制的內毒素清除劑,可最大限度地除去內毒素。從1-5ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中,可快速提取5-15μg高純度質粒DNA,提取率達85-90%。使用本試劑盒提取的質粒DNA純度高,可直接用于細胞轉染等要求較高的實驗,以及其他各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇,加入體積請參照瓶體上的標簽(每瓶需單獨加入45mL 無水乙醇)。P1在使用前先加入RNase A(將試劑盒中提供的RNase A全部加入),混勻,置于2-8℃保存。如非指明,所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
第一次開蓋使用后,請將內毒素清除試劑于2-8℃保存,可以縮短使用時的冰上預冷時間。
具體產品的參數(shù)以收到產品說明書的參數(shù)為準
操作步驟(僅供參考):
1. 取 1-5mL 細菌培養(yǎng)物,12000rpm 離心 1min,盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。
2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入200μL P1(請先檢查是否已加入RNase A),使用移液器或旋渦振蕩器che底懸浮細菌細胞沉淀。注意:如菌塊未che底混勻,會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。
3. 向離心管中加入200μL P2,溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。注意:混勻一定要溫和,以免污染細菌基因組 DNA,此時菌液應變得清亮粘稠,作用時間不要超過 5min,以免質粒被破壞。
4. 向離心管中加入200μL P3,立即溫和地上下翻轉6-8次,充分混勻,此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min,用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中,盡量不要吸出沉淀。注意:P3加入后應立即混合,避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清。
5. 加入上清1/5體積的冰上預冷內毒素清除劑,振蕩混勻溶液變渾濁,冰浴5-10min至溶液變清亮。
6. 42℃水浴 5min,不時振蕩,溶液又變渾濁,12000rpm室溫離心5min,溶液應分為兩相,上層水相含質粒DNA,下層油相含內毒素。
7. 將含質粒DNA的上層水相轉移至新管,棄下層油相,注意不要吸入油狀相。重復抽提三次,即重復步驟5-7三次。
8. 加入0.4倍上清體積的無水乙醇,充分混勻后加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),室溫放置2min,12000rpm 離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12000rpm離心1min,棄廢液,將吸附柱放入收集管中。
10. 向吸附柱中加入600μL漂洗液,12000rpm離心1min,棄廢液,將吸附柱放入收集管中。
11. 12000rpm 離心 2min,將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗,如酶切、PCR等。
12. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中,向吸附膜中央懸空滴加50-200μL經65℃水浴預熱的洗脫液,室溫放置2min,12000rpm離心1min。
13. 為了增加質粒的回收效率,可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中,室溫放置 2min,12000rpm 離心1min。
注意事項:
1. 使用前請先檢查P2和P3是否出現(xiàn)混濁,如有混濁現(xiàn)象,可在37℃水浴中加熱幾分鐘,待溶液恢復澄清后再使用。P2、P3、漂洗液使用后應立即擰緊蓋子。
2. 洗脫緩沖液體積不應少于50μL,體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌,若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍),pH 值低于7.0會降低洗脫效率,DNA產物應保存在-20℃,以防DNA降解。
3. 如果所提質粒為低拷貝質?;虼笥?0kb的大質粒,應加大菌體使用量,使用5-10mL過夜培養(yǎng)物,同時按照比例增加P1、P2和P3的用量,吸附和洗脫時可以適當?shù)难娱L時間,以增加提取效率。
4. DNA 濃度及純度檢測:得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。得到的 DNA 可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA 應在OD260處有顯著吸收峰,OD260值為1相當于大約50ug/mL雙鏈DNA、40ug/mL單鏈DNA。OD260/OD280比值應為 1.7-1.9,如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水,比值會偏低,因為pH值和離子存在會影響吸光值,但并不表示純度低。
去內毒素質粒小量提取試劑盒-常備現(xiàn)貨
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D9928 去內毒素質粒小量提取試劑盒 Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit 50T/100T
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