谷an酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

谷an酰胺合成酶試劑盒 氨基酸

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷an酸合成谷an酰胺，不僅可以防止過多的銨離子對(duì)生物有毒性，而且谷an酰胺也是氨的主要儲(chǔ)存和運(yùn)輸形式。

測(cè)定原理：

GS 在ATP 和Mg²⁺存在下，催化銨離子和谷an酸合成谷an酰胺；谷an酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下形成的絡(luò)合物在 540nm 處有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。

組成：

試劑一臨用前 37℃預(yù)熱 20min，充分混勻，如有沉淀，靜置 10min，取上清待用。試劑二臨用前 37℃預(yù)熱 20min，充分混勻，如有沉淀，靜置 10min，取上清待用。試劑三用時(shí)每瓶加入 5ml 蒸餾水充分溶解待用。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在EP 管中加入下列試劑：

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 30min

混勻，25℃室溫靜置 10min 后，5000g，25℃離心 10min，取上清液測(cè)定 540nm 處的吸光值A(chǔ)?！鰽=A

測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

GS 活力單位的計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.8348x + 0.0008，R2 = 0.9999

1、血清（漿）GS 活性

單位定義：每ml 血清（漿）在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式：

GS（μmol/h/ml）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷V 樣÷T=10.268×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 GS 活性

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=10.268×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/104 cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.021×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.75ml； V 樣：加入樣本體積，0.175ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml； T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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