海藻糖酶（Trehalase，THL）試劑盒說(shuō)明書

微量法 100 管/48 樣

海藻糖酶Trehalase THL試劑盒 糖代謝

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

THL（EC 3.2.1.28）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。海藻糖酶主要功能在于生物體分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供應(yīng)。

測(cè)定原理：

THL 催化海藻糖產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過(guò)氧化氫；過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化 4-氨基安替bi林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰，以此反映THL活性。

組成：

試劑三：液體 10ml×1 瓶，4℃保存；（若出現(xiàn)結(jié)冰現(xiàn)象，可 37℃水浴溶解后使用）

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次）；8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（ml）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議取 0.1ml 血清（漿）加入 1ml 提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 505nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3、工作液的配制：使用前將試劑二和試劑三 1:1 等體積混合，用多少配多少。

4、加樣表：

45℃水浴，準(zhǔn)確反應(yīng) 15min，95℃水浴 5 分鐘終止反應(yīng)，得混合液(若出現(xiàn)沉淀可 10000g

4℃離心 10min 后取上清)。

混勻，置 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25'C（其它物種）保溫 15min 后，于 505nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度。計(jì)算

ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

THL 活力計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.4858x - 0.0042，R2 = 0.9999；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為吸光值。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000

=366× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=366×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=0.732×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體積計(jì)算

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/ml)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(V 液 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=3660×(ΔA+0.0042)

V 樣：加入樣本體積：0.03ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.08ml；V 液：加入血清（漿）體積，0.1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，15min；

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.2429x - 0.0042，R2 = 0.9999；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為吸光值。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000

=732× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=732×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=1.464×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體積計(jì)算

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/ml)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(V 液 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=7320×(ΔA+0.0042)

V 樣：加入樣本體積：0.03ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.08ml；V 液：加入血清（漿）體積，0.1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，15min；

海藻糖酶Trehalase THL試劑盒 糖代謝