纖維素酶（cellulase，CL）/羧甲基纖維素酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣

纖維素酶/羧甲基活性測(cè)定試劑盒 糖代謝

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

CL（EC 3.2.1.4）存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)，能夠催化羧甲基纖維素降解，是一類(lèi)可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領(lǐng)域的酶制劑。

測(cè)定原理：

采用蒽酮比色法測(cè)定CL催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存； 臨用前加入 5ml 蒸餾水和 45ml 濃硫酸充分溶解待用。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、濃硫酸和蒸餾水。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

加樣表和測(cè)定步驟：

37℃振蕩反應(yīng) 1h 后，90℃水浴 15min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后

8000g 25℃離心 10min，取上清，得糖化液

混勻， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻，取 200μl 至微量石英比色皿或 96 孔板中，測(cè) 620nm 下吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CL 活力計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 5.018x - 0.0462；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、血清（漿）CL 活力的計(jì)算

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min/ml)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷V 樣÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 CL 活力的計(jì)算

按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.0796×(ΔA+0.0462)

1000：1mg/ml=1000ug/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.6ml； V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為 y = 2.5090x - 0.0462；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、血清（漿）CL 活力的計(jì)算

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min/ml)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷2.509×V 反總]÷V 樣÷T =79.6×(ΔA+0.0462)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 CL 活力的計(jì)算

按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=79.6×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=79.6×(ΔA+0.0462)÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /104cell)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.1592×(ΔA+0.0462)

1000：1mg/ml=1000ug/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.6ml； V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

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