內(nèi)切-β-1 4-葡聚糖酶（Cx）活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

內(nèi)切-β-1 4-葡聚糖酶活性測定試劑盒糖代謝

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

Cx（EC3.2.1.4）存在于細(xì)菌、真菌和動物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份之一，Cx主要作用于非晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機(jī)水解糖苷鍵，將其分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚體。

測定原理：

采用3,5－二硝基水楊酸法測定Cx催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

組成：

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在EP 管中依次加入下列試劑）：

混勻，37℃準(zhǔn)確水浴 2h

混勻， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，取 200μl 至微量石英比色皿或 96 孔板中，測540nm 下吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。

Cx 活性計(jì)算

用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 6.4078x - 0.0673；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、血清（漿）Cx 活力的計(jì)算

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min/ml)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷V 樣÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 Cx 活力的計(jì)算

按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/ml=1000ug/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.11ml； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 3.2039x - 0.0673；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、血清（漿）Cx 活力的計(jì)算

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min/ml)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反總]÷V 樣÷T

=28.61×(ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 Cx 活力的計(jì)算

按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.057×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/ml=1000ug/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.11ml； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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