土壤中性磷酸酶（S-NP）活性測定試劑盒說明書

微量法 100T/96S

土壤中性磷酸酶S-NP活性測定試劑盒

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

土壤磷酸酶是催化土壤有機(jī)磷礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。磷酸酶活性受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH的顯著影響，根據(jù)最適PH 范圍，一般把土壤磷酸酶分為中性、酸性和堿性三種類型。

測定原理：

中性環(huán)境中，S-NP 催化磷酸苯er鈉水解生成ben酚和磷酸氫er鈉，通過測定酚的生成量即可計(jì)算出NP活性。

試劑組成和配制：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。用前加 100ml 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 576μl 無水乙醇（自備），24μl 蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 瓶，0.5 μmol/ml 酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、臺式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、乙醇和甲苯。

催化反應(yīng)：

稱取風(fēng)干混勻土壤約 0.1g，加入 50μl 甲苯（自備），輕搖 15min；加 400μl 試劑一并且搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，開始計(jì)時(shí)，催化反應(yīng) 24h；到時(shí)后迅速加入 1ml 試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。

8000g，25℃離心 10min，取上清液置于冰上待測。

顯色反應(yīng)：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

空白管：取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板，加入 10μl 蒸餾水，20μl 試劑三，4μl 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 166μl，混勻后 25℃靜置 30min，于 660nm 測定吸光度，記為 A 空白管。

標(biāo)準(zhǔn)管：取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板，加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液，20μl 試劑三，4μl 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 166μl，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660nm 測定吸光度，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

測定管：取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板，加入 10μl 上清液，20μl 試劑三，4μl 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 166μl，混勻后室溫 25℃30 min，于 660nm 測定吸光度，記為 A 測定管。

注意事項(xiàng):

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放 1nmol 酚為 1 個(gè)酶活單位。

S-NP（μmol/d/g 土樣）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷W÷T

= 0.725×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/ml；V 總：催化體系總體積，1.45ml；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，24 h=1 d。

土壤中性磷酸酶S-NP活性測定試劑盒