4-香豆酸：輔meiA 連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

4-香豆酸：輔meiA 連接酶試劑盒 其他系列

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸輔meiA酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和CoA 生成 4-香豆酸CoA，在 333nm 下測 4-香豆酸CoA 生成速率，即可反映 4CL活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

細菌或培養(yǎng)細胞：

先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀 40℃預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 333nm，蒸餾水調(diào)零。

準(zhǔn)備 96 孔UV 板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測波長小于 340nm 務(wù)必使用UV 板）。

2、樣本測定

在試劑二中加入 5ml 試劑一充分溶解混勻，置于 40℃水浴預(yù)熱 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h內(nèi)用完）；

對照管：在微量石英比色皿或 96 孔UV 板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑一，混勻，立即記錄 333nm處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值A(chǔ)1。

測定管：在微量石英比色皿或 96 孔UV 板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑二，混勻，立即記錄 333nm處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。每個測定管設(shè)一個對照管。

4CL 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸輔meiA 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔meiA 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=31.75×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔meiA 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.063×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：4-香豆酸輔meiA 摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比 色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，30 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 4-香豆酸輔meiA 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=63.49×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔meiA 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=63.49×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔meiA 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.127×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：4-香豆酸輔meiA 摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，30 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

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