高鐵還原酶（ferric-chelate reductase, FCR）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

高鐵還原酶（ferric-chelate reductase, FCR）催化高價(jià)鐵螯合物中的Fe3+還原為Fe2+，在部分物種鐵元素的吸收中有重要作用。

測(cè)定原理：

FCR 催化Fe³⁺還原為Fe²⁺，F(xiàn)e²⁺和ferrozine 反應(yīng)顯色，在 562nm 下有特征吸光值。

試劑組成和配制：

需自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：水（ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 蒸餾水），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 562nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液配制：將試劑一、二、三以 1:1:1 的比例混合。臨用前配制，用多少配多少。

在微量石英比色皿/96 孔板中，加入 50μl 樣本上清和 150μl 工作液，混勻，記錄初始吸光值 A1 和 30min后的吸光值A(chǔ)2。ΔA=A2-A1。

FCR 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 8.0014x + 0.0011，R2 = 0.9997；

按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每 g 樣本每分鐘產(chǎn)生 1nmolFe2+-ferrozine 定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0011）÷ 8.0014×1000×V 標(biāo)÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T = 4.166×（△A-0.0011）÷W

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmolFe2+-ferrozine 定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0011）÷8.0014×1000×V 標(biāo)÷(V 樣÷V 樣總×Cpr)÷T=4.166×（△A-0.0011）÷Cpr

V 樣總：加入提取液體積，1 ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，50μl；V 標(biāo)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積 ，50μl；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；1000，μmol 到nmol 的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 4.0007x + 0.0011，R2 = 0.9997；y，吸光度按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每 g 樣本每分鐘產(chǎn)生 1nmolFe2+-ferrozine 定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0011）÷4.0007×1000×V 標(biāo)÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T=8.331×（△A-0.0011）÷W

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmolFe2+-ferrozine 定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0011）÷4.0007×1000×V 標(biāo)÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T =8.331×（△A-0.0011）÷Cpr

V 樣總：加入提取液體積，1 ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，50μl；V 標(biāo)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積 ，50μl；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；1000，μmol 到nmol 的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

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