諾博萊德 Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理載體

pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒

目錄號(hào)：42119

試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

－20℃儲(chǔ)存，6個(gè)月內(nèi)不影響使用效果。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品介紹：

pBLUE-T Simple Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專(zhuān)用載體。這種載體是由pBlueScript II SK(+)質(zhì)粒改建而成，和傳統(tǒng)T載體ECOR V切開(kāi)后加T方法不同，pSURE-T Simple 通過(guò)改造pBlueScript II SK(+)，在原pBlueScript II SK(+)多克隆位點(diǎn)引入 Xcm I酶切后使其原多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的3’末端直接產(chǎn)生未配對(duì)的T堿基，因此有更高的重組效率。同時(shí)它消除了pBlueScript II SK(+)載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，需要在PCR擴(kuò)增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn)。此時(shí)如果使用PCR擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA酶切時(shí)，酶切反應(yīng)將不會(huì)受到T載體上其它多克隆酶切位點(diǎn)上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。此外，本公司載體連接體系還有背景低（藍(lán)斑小于10%），重組率高（白斑中超過(guò)90%有插入片段），可快速連接等特點(diǎn)。本說(shuō)明書(shū)末列出了pBLUE-T Simple 載體相關(guān)的技術(shù)資料，其全序列可參照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位點(diǎn)處序列稍有不同。

測(cè)序推薦采用M13通用測(cè)序引物和T3啟動(dòng)子引物（見(jiàn)后面圖譜）
操作步驟：
1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備

PCR產(chǎn)物是否要進(jìn)行純化取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量。如果PCR產(chǎn)物非常干凈，不經(jīng)純化就可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。但如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則必須進(jìn)行純化，模板質(zhì)粒有可能也形成白斑。PCR產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對(duì)70bp以上的DNA片段能很好地進(jìn)行回收。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其末端都帶有一個(gè)突出的3’ -A。 具有3’ -A末端的PCR產(chǎn)物可以直接用pBLUE-T Simple 載體進(jìn)行克隆連接。具有3’®5’外切酶活性的DNA聚合酶（高保真酶）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平末端，要對(duì)這種平末端PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，應(yīng)先進(jìn)行3’--端加A工作。

2.    常規(guī)連接反應(yīng)：

1)   在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10 ml連接反應(yīng)體系中，加入1 ml 30ng pBLUE-T Simple載體、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒(méi)有必要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行精確定量，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1就可以得到良好結(jié)果，推薦3:1)、1ml 10′ligation Buffer和0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase，其余用水補(bǔ)足。反應(yīng)按以下體系進(jìn)行：

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)   16℃連接過(guò)夜（一般可在PCR儀器完成）。

通常推薦16℃連接過(guò)夜（10ml體系標(biāo)準(zhǔn)連接酶量為2.5 Weiss Units即可），可以得到最多的轉(zhuǎn)化子。但是本系統(tǒng)含PEG Enhancer可以提高連接效率數(shù)倍，在高連接酶量的情況下（10ml體系推薦連接酶量為5 Weiss Units）16℃連接30分鐘即可達(dá)一般研究的要求。

3)   冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。

3. 快速連接反應(yīng)：

1)   反應(yīng)按以下體系進(jìn)行：

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)   22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。

2 ′Quick Ligation Buffer已經(jīng)包含所有優(yōu)化的快速連接成份，通常推薦22℃連接10分鐘（10ml體系連接酶量為5 Weiss Units，長(zhǎng)片段連接可以延長(zhǎng)至30分鐘）一般可以得到滿意結(jié)果。此外本系統(tǒng)也可在16℃連接30分鐘（10ml體系連接酶量為5 Weiss Units）即可達(dá)一般研究的要求。

3)   冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。

4.   轉(zhuǎn)化：

e 50-100ml感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完quan解凍后輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。

e 加入4－5ml連接液(最多可全部加入，只要體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。

e 加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘。

e  將200ml細(xì)菌涂布在預(yù)先用16ml 50mg/ml IPTG和40ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐qieng霉素平板上。

涂布細(xì)菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的感受率而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如果 預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過(guò)離心（4,000rpm，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個(gè)平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少，可將剩余菌液全部涂一個(gè)新培養(yǎng)板)。

e  平板在37℃下正向放置1小時(shí)以吸收過(guò)多的液體，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

5     篩選：

1). 轉(zhuǎn)化子的藍(lán)白篩選：

當(dāng)外源DNA片段插入到pBLUE-T Simple 中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物b-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍(lán)色。有的時(shí)候插入片段沒(méi)有影響lacZ 基因讀碼框， 或插入片段太小，這種情況下菌落（重組克?。┏尸F(xiàn)淡藍(lán)色或者在菌落中心呈現(xiàn)淡藍(lán)斑點(diǎn)，外圈白色（魚(yú)眼狀藍(lán)斑fish eye）。選擇在IPTG/X-gal平板上生長(zhǎng)的白色菌落或者淡藍(lán)色菌落，用牙簽挑至含氨芐qieng霉素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

2).  轉(zhuǎn)化子的鑒定：

a.     用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，用插入片段所帶酶切位點(diǎn)酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。

b.     挑取白色菌落直接進(jìn)行PCR檢測(cè)

c.     用T3啟動(dòng)子引物或M13通用測(cè)序引物測(cè)序來(lái)確定是否含有目的克隆。

e 如何計(jì)算連接反應(yīng)中需要的PCR產(chǎn)物的量?

一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：

[加入載體的量（ng）×插入片段大?。╧b）÷載體大?。╧b）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng，插入片段大小為1000bp，這時(shí)應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體×1kb插入片段÷2.928kb載體]×3/1=40.1ng。 

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