脫氫酶（dehydrogenase, DHA）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，催化底物通過(guò)細(xì)胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機(jī)體使用，是生物體取得能量的一種方式。

測(cè)定原理：

在細(xì)胞呼吸過(guò)程中，氫受體 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈現(xiàn)紅色，在波長(zhǎng) 485nm處有最大吸收峰，采用分光光度法于 485nm 測(cè)定其吸光值，即得脫氫酶活性。

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試劑的組成和配制：

試劑一：粉劑×1 瓶，使用前加 10ml 試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

需自備儀器和用品：

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請(qǐng)用戶自備）。

樣品處理：

1、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 8000g，4℃，離心 20min。

3、液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

充分混勻，37℃培養(yǎng) 24h

振蕩 1h，8000g，25℃，離心 5min，取 1ml 上清于比色皿，測(cè)定A485，△A=A 測(cè)定-A 空白管?？瞻?/span>管只要做一管。

脫氫酶活力計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R2 = 0.9988；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ml），y 為吸光值。

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：在 37℃時(shí)，每mg 蛋白樣品每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：在 37℃時(shí)，每克樣品每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：在 37℃時(shí)，每ml 樣本每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /ml）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷V 樣÷T= 0.181×（△A+0.0312）

V 反總：反應(yīng)總體積，1.65ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.15ml；T：培養(yǎng)時(shí)間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g； Cpr：蛋白濃度，mg/ml。

注意事項(xiàng)：

配制好的試劑一避光保存于 4℃，最好在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。

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