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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

魚腸道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科弧菌屬。魚腸道弧菌分離自腸部發(fā)生病變壞死的牙鲆。魚腸道弧菌可引起牙鲆、石鰈、大菱鲆等多種海水魚類肝臟、腎腫脹及產(chǎn)生腹水，表現(xiàn)為全身性敗血癥感染。腸道弧菌有時(shí)還會(huì)與其他弧菌一起引發(fā)混合感染, 給魚類養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此快速檢測(cè)魚腸道弧菌具有重要的意義。為此，本公司以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了魚腸道弧菌的檢測(cè)試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)魚腸道弧菌DNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法qPCR反應(yīng)。

7.魚腸道弧菌探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測(cè)需求。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、魚腸道弧菌 qPCR 引物-探針干粉、魚腸道弧菌qPCR 陽(yáng)性對(duì)照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊(cè)。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在6號(hào)管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7.如果有N個(gè)樣品，最好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10 μL上步所得第4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA-提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第6步第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分樣品管

N+2個(gè)PCR

陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6管）

2×Probe qPCR MasterMix各10 μL10 μL各10 μL

魚腸道弧菌qPCR      引物-探針混合液各3 μL3 μL各3 μL

 N+2個(gè)待測(cè)DNA樣本各7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第6步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品稀釋液（1-6號(hào)）不加不加各7 μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行qPCR：

過程溫度時(shí)間

預(yù)變性95℃10 min.

PCR反應(yīng)

（45個(gè)循環(huán)）95℃15 sec.

60℃ 30 sec（采集FAM通道的熒光信號(hào)，淬滅基團(tuán)為TAMRA）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽(yáng)性對(duì)照或PCR陽(yáng)性對(duì)照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對(duì)照或PCR陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

13.如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于40。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct沒有讀數(shù)、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽(yáng)性。

選擇我們的魚腸道弧菌探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！