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產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測丹毒絲菌的試劑盒。丹毒絲菌（Erysipelothrix）是一類革蘭氏染色陽性菌，在自然界中廣泛存在。丹毒絲菌屬起的丹毒絲菌病是一種急性細菌性疾病，其病理特征為在感病動物皮膚上形成紅色凸起的斑塊。丹毒絲菌感染人和多種動物，嚴重影響人和動物健康，因此快速檢測丹毒絲菌屬具有重要意義。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏度高，最-低檢測限可達 100 拷貝/反應。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)丹毒絲菌屬基因組 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其它生物的 DNA 發(fā)生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時，線性范圍至少 5 個數(shù)量級。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7.丹毒絲菌屬通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、丹毒絲菌屬通用 qPCR 引物-探針干粉、丹毒絲菌屬通用qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能  污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭（下同）。

3.在 6 號管中加入 5 μL1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩混勻 1 分鐘，得到 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩混勻 1 分鐘，得到 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步所得)，充分震蕩混勻 1 分鐘，得到 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.依次重復上面的操作得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對

照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10 μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA- 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)

置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最  后加）：

成分樣品管

N+3 個PCR 陰性

對照管標曲樣品管

（1-6）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

丹毒絲菌屬 qPCR 引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

待測樣本 DNA 模板7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6 號）

不加

不加各 7 μL（1 號樣到 1 號管，2 號樣到 2 號管…）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果擴增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不  需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰  性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)  據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。

13.如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無 Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性。

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