在蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品的質(zhì)控要求中，需要對 蛋白氨基酸序列進行確證，對相關(guān)修飾進行 鑒定以及定量——即肽圖分析。肽圖的液質(zhì)實 驗流程主要包括：蛋白的變性、二硫鍵的還 原與烷基化、以及蛋白酶酶解（通常使用胰 蛋白酶 Trypsin）、液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù) 處理幾個步驟（圖1）。在這個流程中， Orbitrap 型質(zhì)譜以其超高分辨、高質(zhì)量精度、 高靈敏、高穩(wěn)定性成為業(yè)內(nèi)推崇的質(zhì)譜分析 平臺。除此之外，考慮到生物制藥應(yīng)用的特 殊需求 ， 根據(jù)蛋白藥物質(zhì)譜分析特點 ， Thermo Fisher與世界制藥企業(yè)Amgen聯(lián) 合開發(fā)了 PepFinderTM 軟 件 。 實際上 ， PepFinder來源于Amgen內(nèi)部的自制的肽圖分 析軟件，因此其功能設(shè)計從一開始就聽從了 一線分析人員的切實需求 [1,2] ， 而 Thermo Fisher的加入，則使軟件底層對質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 的性能大大提高。因此，PepFinder一經(jīng)公開 發(fā)布，就受到了業(yè)內(nèi)的極大關(guān)注與好評。
除基本的肽段序列確認、覆蓋率分析、 修飾位點鑒定與定量、錯配二硫鍵發(fā)現(xiàn)、圖 譜對比、CID/HCD/ETD碎片解析等功能外， PepFinder還*未知修飾發(fā)現(xiàn)、氨基酸突變 查找功能[1-5] 。這兩項功能可以幫助大家快速 發(fā)現(xiàn)序列變異，避免可能出現(xiàn)的巨大的質(zhì)量 風險。不僅如此，PepFinder還有更多貼心的 功能設(shè)計，如內(nèi)置了CHO細胞系糖型，并可一 鍵選擇進入糖肽分析流程；再如，除具有肽 段鑒定可信度評價功能外，還可智能顯示多 肽的理論質(zhì)譜碎片，并用于與實驗圖譜直觀 對比，以輔助分析，并可快速提高分析員質(zhì) 譜解析水平。這些功能不但減少工作強度， 也降低了對分析員理解質(zhì)譜數(shù)據(jù)深度的要求[6- 11] 。更具情懷的是，對于氨基酸固定修飾設(shè)置， 不同于其它類似軟件（固定修飾只可至 某一類氨基酸），在PepFinder中，可以 到特定的某個氨基酸位點。此功能對于蛋白 藥的某些特殊分析需求提供了極大的便利。
圖2為PepFinder的氨基酸序列鑒定覆蓋率 結(jié)果顯示圖 。 相較于其它類似軟件 ， PepFinder的覆蓋率顯示方法更適用于蛋白藥 物肽圖分析，其中不僅包括了結(jié)果總結(jié)與具 體的鑒定情況，還含有鑒定序列的色譜保留 時間與強度信息。這些便捷的信息顯示為某 些情況下的肽圖方法開發(fā)，指出了優(yōu)化方向。修飾的鑒定與定量也是肽圖分析中的必須 項目。Orbitrap具有的靈敏度與準確性， 配合PepFinder軟件，使此項分析工作不再繁 重。圖3中，為一蛋白藥物某肽段中色氨酸殘 基(W)的正常形式與雙氧化形式的二級鑒定圖 譜。其中雙氧化形式肽段豐度僅為總量的 0.13%，但仍得到了高質(zhì)量的碎片與定量信息。
圖4為另一常見的多肽修飾——脫氨基 (deamidation)。在此例中，同一個肽段內(nèi)含有 兩個天冬酰胺(N)，通過液質(zhì)分析，不但實現(xiàn) 了對脫酰胺化肽段的鑒定與定量，而且對于 不同位置的脫酰胺化，Orbitrap都采集到了高 質(zhì)量的二級碎片信息，使之得以分辨。
圖5顯示了針對蛋白質(zhì)藥物分析的一些特 殊參數(shù)設(shè)置，如二硫鍵檢索、CHO細胞系糖肽 檢索、未知修飾發(fā)現(xiàn)、氨基酸突變鑒定等功 能。這些功能有助于提高分析人員的工作效 率，降低數(shù)據(jù)分析難度，更可以幫助及時發(fā) 現(xiàn)可能導(dǎo)致蛋白藥物質(zhì)量問題的潛在風險。
質(zhì)控部門的工作要求其成員能熟練進行 多種不同的分析實驗操作。相對于其它技術(shù) 而言，質(zhì)譜分析更為復(fù)雜，難度相對較大。 為了提升工作效率、降低質(zhì)譜使用進入門檻， Orbitrap系列質(zhì)譜采用了盡可能簡化的操作界 面設(shè)計，即使沒有質(zhì)譜操作經(jīng)驗的人員，也 可以在一個工作日內(nèi)掌握儀器的日常維護、 校正、采集方法設(shè)置等操作。但是對于質(zhì)譜 數(shù)據(jù)分析工作來說，不可能一蹴而就，而是 需要經(jīng)驗積累的。為了幫助使用者能更快地 具備豐富的質(zhì)譜分析經(jīng)驗，PepFinder特意設(shè) 置了理論圖譜功能（圖6）。此功能可根據(jù)肽 段的氨基酸序列，通過Kinetic Model計算出肽 段的理論碎片圖譜[6-11] ，并與實驗圖譜對比顯 示。這樣就為實驗人員提供了為直觀的質(zhì)譜圖譜觀察途徑，可輔助判斷圖譜質(zhì)量，并 可幫助分析者快速積累質(zhì)譜分析經(jīng)驗。
肽圖分析是蛋白質(zhì)藥物研發(fā)及質(zhì)控為常 用的分析手段之一。其可以提供為精細的 序列結(jié)構(gòu)及修飾信息，因此參與到了細胞株 篩選、細胞培養(yǎng)、純化、制劑工藝優(yōu)化等各 個階段。在每次分析中，都需要從肽圖數(shù)據(jù) 中挖掘出大量重要的信息，使其成為質(zhì)控與 研發(fā)分析中較為繁重的一項工作。PepFinder 直接基于Amgen的一線分析需求進行設(shè)計開發(fā)， 并經(jīng)過了多年的內(nèi)部使用，因此成為蛋白藥 物質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析中的軟件。 PepFinder與Orbitrap系列質(zhì)譜的聯(lián)合運用已成 為業(yè)內(nèi)*的實驗分析平臺。
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