配方乳——脂溶性維生素
維生素是人和動(dòng)物為維持正常的生理功能而必須從食物中獲得的一種微量有機(jī)物質(zhì)，根據(jù)物理性質(zhì)不同分為水溶性和脂溶性?xún)纱箢?lèi)，其中脂溶性維生素A、D、E在人體的視覺(jué)能力、免疫功能、抗氧化抗衰老能力等諸方面都有著重要的生理功能。維生素不足會(huì)造成人體的亞健康，因此對(duì)于維生素的補(bǔ)充越來(lái)越受到人們的重視。嬰幼兒及成人配方乳品是脂溶性維生素強(qiáng)化的重要形式之一。
配方奶粉基質(zhì)復(fù)雜，我國(guó)和歐洲的關(guān)于食品中維生素 D 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法中，需采用正相制備色譜、反相分析色譜兩套儀器，分別進(jìn)行凈化制備和分析，分析效率很低。
賽默飛很早提出了二維液相的解決方案，采用一套液相兩根色譜柱中心切割的方法可以將維生素A、D、E異構(gòu)體*分離，方案被伊利、君樂(lè)寶等諸多乳品企業(yè)所采用。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，介紹更省時(shí)的超快速在線二維方案和既省時(shí)又省力的在線固相萃取-二維液相方案。
超快速在線二維方案
本方案儀器配置如下
儀器：Thermo Fisher Vanquish高效液相色譜儀
泵：Vanquish Dual Pump（VF-P32-A-01）
自動(dòng)進(jìn)樣器：Vanquish Autosampler (VF-A10-A, 100 μL Sample Loop）
柱溫箱：Vanquish Column Compartment（VH-C10-A, 含兩個(gè)Viper Only 2p-6p切換閥）
檢測(cè)器：Vanquish Diode Array Detector HL（含10mm或60mm光纖池）
樣品收集環(huán)體積：500 μL
色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3
儀器連接圖見(jiàn)圖2。
圖2 儀器連接圖（超快速在線二維方案）
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供試品溶液制備
參考GB 5009.82-2016的方法，精密稱(chēng)取固體奶粉試樣約10 g（精確到0.01 g）于150 mL平底燒瓶中，用約30 mL 45 ℃～50 ℃溫水使其溶解，混勻。于上述處理的試樣溶液中加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻，加入30 mL無(wú)水乙醇，充分混勻后加入約20 mL 0.5 g/g的氫氧化鉀水溶液混勻，在80 ℃恒溫水浴振蕩皂化約30 min后，取出立刻用冷水冷卻到室溫。
將上述皂化液轉(zhuǎn)移入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙醚混合液（1:1, V:V），振蕩萃取5 min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)250 mL分液漏斗，加入50 mL石油醚-乙醚混合液再次萃取，合并醚液，用約100 mL水洗滌醚液，重復(fù)3次，至醚液洗至中性。
醚液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水過(guò)濾，濾液收入250 mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在40 ℃水浴旋蒸至約2 mL，立即氮?dú)獯蹈桑眉状紡?fù)溶轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶后定容，上機(jī)分析。12min即可完成維生素A、D、E異構(gòu)體7個(gè)化合物的分析，測(cè)定譜圖見(jiàn)圖3。
圖3維生素A、D和E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分析譜圖（a：維生素A；b：維生素D2和D3；c：維生素E）
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在線固相萃取-二維液相方法
上面介紹的超高效液相平臺(tái)方案給大家節(jié)省了分析時(shí)間，下面這個(gè)方案可在賽默飛常規(guī)液相上運(yùn)行，結(jié)合在線固相萃取，可以實(shí)現(xiàn)皂化液直接上機(jī)分析，省時(shí)又省力。
樣品皂化過(guò)程同上，皂化后，取出立刻用冷水冷卻到室溫，用50%乙醇水溶液轉(zhuǎn)移并定容到100mL量瓶中。皂化液高速離心5～10min（>5000rpm）后用0.22μm尼龍材質(zhì)針式過(guò)濾器過(guò)濾后上機(jī)分析。
該方案儀器配置上采用三泵兩檢測(cè)器雙閥
實(shí)驗(yàn)所用儀器配置如下：
儀器：Thermo Fisher Vanquish高效液相色譜儀
泵：Vanquish Dual Pump（VF-P32-A-01）和Vanquish quatery Pump (VF-P20-A)
自動(dòng)進(jìn)樣器：Vanquish Autosampler (VF-A10-A, 100 μL Sample Loop）
柱溫箱：Vanquish Column Compartment（VH-C10-A, 含兩個(gè)Viper Only 2p-6p切換閥
檢測(cè)器：Vanquish Diode Array Detector HL（含10mm或60mm光纖池），U3000 VWD3100 Detector（含11 μL流通池）
樣品收集環(huán)體積：500 μL
色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3
儀器連接圖見(jiàn)圖4，測(cè)定譜圖見(jiàn)圖5和圖6。
圖4 儀器連接圖（在線固相萃取-二維方案）
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圖5. Vd測(cè)定譜圖（a為對(duì)照品，b為樣品）
圖6. Va和Ve測(cè)定譜圖（a為對(duì)照品，b為樣品）
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總結(jié)
賽默飛為大家提供了多種維生素A、D、E異構(gòu)體的測(cè)定方案，方案涵蓋常規(guī)液相和超高效液相、離線SPE和在線SPE，無(wú)論是對(duì)于現(xiàn)有儀器的升級(jí)改造還是全新平臺(tái)的建立都可以找到對(duì)應(yīng)的選擇。現(xiàn)代化的儀器方法提高了奶粉樣品中脂溶性維生素的分析效率，減少了每日多批次樣品檢測(cè)任務(wù)的繁重。
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