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關(guān)鍵詞 全自動(dòng) SRM 離子對(duì)優(yōu)化軟件（AutoSRM）；生物標(biāo)記物；食 品；代謝組學(xué)；MRM；營養(yǎng)學(xué)；大米

前言 代謝組學(xué)是一門應(yīng)用高通量測試平臺(tái)研究生物代謝過程中的小 分子代謝物的科學(xué)。作為生物體內(nèi)眾多代謝反應(yīng)的產(chǎn)物，其代 謝物的含量始終處于動(dòng)態(tài)變化中。因此，所謂“代謝組特征” 反映的是來自于活體組織的生物樣本的生理狀況。1 對(duì)于植物來說，其代謝組主要受遺傳基因以及環(huán)境影響等外部 刺激作用而在生長過程中不斷變化。因而，通過測試所獲得的 代謝組特征僅為該植物某組織器官在特定生長階段生理狀況的 剪影。對(duì)樣本中代謝物的定性和定量結(jié)果可作為此代謝組狀態(tài) 的“指紋圖譜”或指示譜圖。據(jù)估計(jì)，所有植物生長過程中存 在超過 20 萬種代謝物，這些代謝物數(shù)量眾多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。2 代謝組學(xué)分析的大挑戰(zhàn)在于代謝物結(jié)構(gòu)性質(zhì)的多樣性以及含 量的巨大差異。要對(duì)整個(gè)代謝組體系中的代謝物進(jìn)行測試，必 須應(yīng)用多種測試平臺(tái)。 對(duì)于研究可通過化學(xué)衍生法處理進(jìn)行氣相色譜分析的低分子量 代謝物來說，氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）是測試 工具。在使用氣質(zhì)聯(lián)用儀一級(jí)全掃描模式表征代謝物，可識(shí)別 相關(guān)代謝物并提供其歸一化相對(duì)含量信息，然而，對(duì)代謝物整 體定量研究的要求是獲得準(zhǔn)確的定量信息。在研究大米等 某一植物時(shí)，需要對(duì)作為功能基因組學(xué)工具或區(qū)別不同種屬、 品質(zhì)大米的生物標(biāo)記物的目標(biāo)代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定量

三重四極桿質(zhì)譜儀由于其在復(fù)雜有機(jī)樣本中對(duì)待測物進(jìn)行定性 和定量的能力而成為代謝組學(xué)研究中價(jià)值的工具之一。3, 4 三重四極桿質(zhì)譜的主要優(yōu)勢是利用其多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）功能，一次進(jìn)樣同時(shí)定性和定量上百種代謝物。MRM 數(shù)據(jù)采 集模式通過監(jiān)測目標(biāo)代謝物*的、保留時(shí)間相關(guān)的母離子子離子轉(zhuǎn)化反應(yīng)，有效消除基質(zhì)和噪音的干擾。并且，共流出 化合物也可以分別定量，無需通過數(shù)學(xué)計(jì)算進(jìn)行解卷積處理。 作為一種食物來源，大米對(duì)于我們至關(guān)重要，它為約 21% 的 人口提供了能量供給（http://www.knowledgebank.irri.org/）。 大米的代謝組研究可用于對(duì)不同大米樣本進(jìn)行“指紋圖譜” 識(shí)別，以鑒定出具有發(fā)展?jié)摿Φ姆N屬，從而揀選更好品質(zhì)、 具備更多營養(yǎng)成分的大米。位于菲律賓馬尼拉的稻米研究 機(jī)構(gòu)（International Rice Research Institute, IRRI）是目前亞洲 大的非營利性農(nóng)業(yè)研究中心。IRRI 以提高稻米產(chǎn)量和營養(yǎng)成 分為目標(biāo)，專注于稻米的新品種開發(fā)。本次分析目的是考察 GC-MS/MS 測試平臺(tái)對(duì)于檢測不同基因型成熟稻粒目標(biāo)代 謝物的適宜性。本實(shí)驗(yàn)與 IRRI 合作完成，旨在建立表征不 同種類稻米的代謝特征的測試流程。

 樣品前處理 大米提取物的衍生化處理依據(jù) Zhou 等人5發(fā)表的用于表征糙 米代謝組學(xué)特征而優(yōu)化的方法完成。將新鮮脫殼的稻粒浸泡于 液氮中，之后研磨過 60 目網(wǎng)篩。稱量 300 毫克糙米粉末，加 入 3 mL 甲醇/水溶液（4:1 v/v），另加入 100 µL 癸酸溶液 （0.30 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。上述樣本渦旋 1 分鐘并靜置 30 分鐘，經(jīng)超聲處理 60 分鐘后 12000g 離心 10 分鐘。取 2 mL 上清液凍干，加入 90 µL 含 1%*基氯硅烷（TMCS） 的雙*基硅烷基三氟yi酰胺（BSTFA）和 80 µL 吡啶進(jìn)行衍 生化?；旌衔锝?jīng) 75℃ 水浴 45 分鐘后移入裝有 200 µL 內(nèi)插管 的 2 mL 氣相色譜樣品瓶中，用于 GC-MS/MS 分析。所有樣 本均在衍生化處理后 24 小時(shí)內(nèi)完成測試。5 實(shí)驗(yàn)條件 12 份大米提取物衍生化樣本均應(yīng)用 Thermo ScientificTM TSQTM 8000 三重四極桿 GC-MS/MS 系統(tǒng)聯(lián)用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 氣相色譜分析，氣相色譜儀同時(shí)配備有分流不 分流進(jìn)樣口 SSL 即時(shí)連接的 SSL 模塊和 Thermo ScientificTM TriPlus RSHTM 自動(dòng)進(jìn)樣器。具體儀器方法見表 1。

圖 1 展示了代謝組學(xué)研究的通用測試流程，首先是第一部分， 無目標(biāo)性地檢測樣本中化合物成分；之后進(jìn)行第二部分，對(duì)第 一部分中鑒定的代謝物進(jìn)行目標(biāo)性的定量分析。 第一部分分析需要通過對(duì)一級(jí)質(zhì)譜全掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行譜圖數(shù)據(jù)庫 檢索來完成相關(guān)化合物鑒定。 第二部分分析則通過選擇性反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式來對(duì)復(fù)雜 基質(zhì)中痕量化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 終用于選擇性定量的多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）是由眾多單獨(dú) 的選擇性反應(yīng)監(jiān)測組成的。

TSQ 8000 系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和 SRM 掃描的能力出 色，能夠直接采集到第一部分和第二部分所需要所有數(shù)據(jù)。儀器 同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和 SRM 掃描的能力使得實(shí)驗(yàn)人員可以 在一次測試中不僅對(duì)已知代謝物定量（目標(biāo)性）的同時(shí)，鑒定未 知代謝物（無目標(biāo)性）。在所有測試流程中，化合物的色譜保留 時(shí)間是不變的，這一點(diǎn)不僅可作為化合物鑒定的依據(jù)之一，更可 以加快建立目標(biāo)性 MRM 測試方法進(jìn)程。因此，Thermo Scientific TSQ 8000 三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)是同時(shí)進(jìn)行未知化合物表征以及 目標(biāo)化合物廣泛定量的理想測試平臺(tái)。 本次應(yīng)用 TSQ 8000 GC-MS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行代謝組學(xué)研究的兩部分 數(shù)據(jù)對(duì)于深入了解稻米品質(zhì)具有重要參考價(jià)值。

結(jié)果 第一部分—無目標(biāo)性分析 測試流程中的第一部分，共測試了 5 種不同的大米樣本。之所以 選擇這幾種大米，是由于它們不同的特性，這樣更有可能測試出 含量具有顯著差異的代謝物。測試樣本的一級(jí)全掃描離子流圖見 圖 2。 選擇其中一個(gè)樣本（3 號(hào)樣本）來建立和優(yōu)化 SRM 方法。這個(gè) 樣本中含有大量有意義的代謝物。 TSQ 8000 三重四極桿質(zhì)譜儀配置了全自動(dòng) SRM 離子對(duì)優(yōu)化 （AutoSRM）功能，這個(gè)軟件包可以快速、自動(dòng)化地建立和優(yōu)化 SRM 分析方法。利用該功能建立一個(gè)優(yōu)化 SRM 方法步驟如下：1.分析母離子—根據(jù)一級(jí)全掃描數(shù)據(jù)，選擇出 66 種感興趣的 代謝物，每個(gè)代謝物選擇 2–3 個(gè)母離子。本步驟需要單獨(dú)進(jìn) 行一次 GC-MS/MS 測試，選擇出的相關(guān)母離子將進(jìn)行進(jìn)一 步的子離子分析。 2.子離子分析—選出在第一步中各代謝物選出的母離子的相應(yīng) 子離子。每個(gè)代謝物均被選出多個(gè)產(chǎn)物離子，這導(dǎo)致每個(gè)代 謝物有 3–7 對(duì)母離子子離子離子對(duì)用于 SRM 優(yōu)化分析。 3.SRM 優(yōu)化分析—優(yōu)化每對(duì)母離子-子離子離子對(duì)的碰撞能 量，以獲得大的離子強(qiáng)度，即靈敏度。在目標(biāo)代謝物進(jìn)入 質(zhì)譜儀后，對(duì)其進(jìn)行快速梯度能量轟擊以提高離子強(qiáng)度。通 過實(shí)時(shí)直接控制儀器，在單次測試中試驗(yàn)了多個(gè)碰撞能量， 從而極大地縮短了建立和優(yōu)化 SRM 方法所需要的周期。僅 測試了 5 針樣品就所有 66 種代謝物的 SRM 方法優(yōu)化。 通過質(zhì)譜圖自動(dòng)解卷積和鑒定軟件（AMDIS）對(duì) TSQ 8000 測 試所得的復(fù)雜離子流圖進(jìn)行解卷積處理，并應(yīng)用美國國家標(biāo)準(zhǔn) 與技術(shù)研究院（NIST）的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫進(jìn)行譜圖檢索。上述的 66 種進(jìn)行 AutoSRM 優(yōu)化的代謝物均通過 2011 NIST 質(zhì)譜圖數(shù) 據(jù)庫檢索匹配其一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖以完成鑒定。

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結(jié)論 應(yīng)用 Thermo Scientific TSQ 8000 對(duì) IRRI 提供的不同基因型的 大米進(jìn)行代謝組學(xué)表征研究，旨在鑒定出能夠區(qū)別不同種類、 品質(zhì)大米的潛在生物標(biāo)記物。無論代謝組學(xué)測試流程中的無目 標(biāo)性分析還是目標(biāo)性定量分析，TSQ 8000 均運(yùn)行良好，展現(xiàn)了 它的一級(jí)質(zhì)譜全掃描、SRM 和同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描 / SRM 掃描模式對(duì)于表征、定量寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的主要代謝物的*優(yōu) 勢。 盡管 TSQ 8000 質(zhì)譜儀是一臺(tái)三重四極桿質(zhì)量分析器，在一級(jí) 質(zhì)譜全掃描模式下所獲得的譜圖仍與 NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫具有良好 的匹配度。通過標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索可對(duì)未知化合物進(jìn)行匹配鑒定， 結(jié)果置信度高。同分異構(gòu)體化合物則可根據(jù)其色譜保留時(shí)間不 同而進(jìn)行區(qū)別，并可根據(jù)其特定的質(zhì)譜碎裂特征進(jìn)行選擇性定 量。 利用 TSQ 8000 配置的 AutoSRM 軟件包建立并優(yōu)化大米樣品中 包括氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸、醇類、糖類（單糖、雙糖）在 內(nèi)的 66 種代謝物的 SRM 方法。整個(gè) SRM 方法可在 24 小時(shí)以 內(nèi)建立并完成優(yōu)化，并對(duì) 12 種不同的大米樣品中的代謝物進(jìn)行 測試。定量結(jié)果具有高重復(fù)率，即使是在基質(zhì)復(fù)雜的衍生化大 米提取物樣品中，超過 90% 的代謝物 RSD 小于 15%。 經(jīng)測試，所有目標(biāo)代謝物在各大米樣品中含量差異明顯，均有 作為鑒定不同種類大米的生物標(biāo)記物的潛力。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)于未 來的水稻多樣性研究打下良好基礎(chǔ)，有助于提高稻谷品質(zhì)和大 米營養(yǎng)價(jià)值。