2019年，國家糧食和物資儲備局辦公室在第330號通知[1]中公開了國家標(biāo)準(zhǔn)《小麥粉》征求意見稿，其中小麥粉的定義為：小麥粉wheat flour是指由普通小麥（六倍體小麥，Triticum aestivum L.）經(jīng)過碾磨制粉，去除部分麩皮和胚并達(dá)到一定加工精度要求的、未添加任何物質(zhì)的、能夠滿足制作面制食品要求的產(chǎn)品。與《關(guān)于進(jìn)一步加強小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告》（2017 年第132號）[2]中關(guān)于小麥粉（通用）中添加物的要求，即“取得‘小麥粉（通用）’生產(chǎn)許可的企業(yè)，不得在小麥粉中添加任何食品輔料”，保持一致。
早前被允許添加之后又被禁止的過氧化苯甲酰（Dibenzoyl peroxide, BPO），在近幾年的食品安全抽檢中時有被檢出，其非法添加的目的主要是給新生產(chǎn)的小麥粉脫色[3]。然而在小麥粉的加工和儲藏過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)顏色加深的現(xiàn)象，即褐變。發(fā)生褐變的主要原因是，小麥籽粒中的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）催化酚類物質(zhì)氧化生成褐色或黑色的醌類物質(zhì)[4]，從而影響了小麥粉的色澤，降低了小麥粉的品質(zhì)。
根據(jù)GB 2760-2014 附錄B[5]中，對食品漂白劑的定義：能夠破壞、抑制食品的發(fā)色因素，使其褪色或使食品免于褐變的物質(zhì)。針對小麥粉的酶促褐變，一些不法的的商販會通過添加具有還原性的硫脲（Thiourea）進(jìn)行漂白，硫脲能夠抑制多酚氧化酶的活性，阻止褐變的發(fā)生，在一定程度上將醌類還原成酚類，掩蓋不好的品質(zhì)，達(dá)到提亮增白的效果。而硫脲的非法添加會刺激呼吸道和腸道，抑制甲狀腺和造血器官的機能，引起咳嗽、胸悶、頭痛、嗜睡、無力、面色蒼白、面部虛腫、基礎(chǔ)代謝降低、血壓下降、脈搏變慢、白細(xì)胞減少等癥狀[6]。早在2001年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)就將硫脲列在了3類致癌物清單中。
原食品藥品監(jiān)督管理總局于2016年發(fā)布第196號公告[7]，公布了食品補充檢驗方法《小麥粉中硫脲的測定 BJS 201602》，補 了充國內(nèi)硫脲檢測標(biāo)準(zhǔn)。為了進(jìn)一步規(guī)范企業(yè)的生產(chǎn)行為，加強小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管，總局于2017年發(fā)布第132號公告[2]，其中明確規(guī)定“嚴(yán)禁生產(chǎn)企業(yè)在小麥粉中添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑、曲酸等非食品原料”。
在此背景下，賽默飛實驗室對高效液相色譜法測定小麥粉中硫脲的實驗條件，開展了相關(guān)研究工作。
01樣品前處理
準(zhǔn)確稱取均質(zhì)小麥粉1.0 g（精確至0.01 g）于15 mL旋蓋螺口圓底離心管中，加入10.00 mL 80:20乙腈水，旋緊蓋子，渦旋分散30 s，水浴超聲提取20 min（由于超聲時間較長，水浴溫度會升高，建議加入冰袋控溫），10000 rpm 4℃ 冷凍離心10 min，取上清液過0.2 μm親水PTFE微孔濾膜，濾液上機測試。
02色譜條件
● 液相色譜儀：UltiMate™ 3000 HPLC 液相色譜系統(tǒng)
● 色譜柱：Syncronis™ HILIC, 250×4.6 mm, 5μm (P/N: 97505-254630)
● 柱溫：20 ℃
● 進(jìn)樣量：5 µL
● 流動相：A為乙腈，B為水
● 洗脫程序：A:B=90:10，等度洗脫
● 流速：1 mL/min
● 檢測波長：246 nm
● 采樣頻率：5 Hz
● 采集時間：12 min
03實驗結(jié)果與討論
3.1色譜條件優(yōu)化
3.1.1 色譜柱選擇
硫脲標(biāo)準(zhǔn)品溶液在Syncronis HILIC色譜柱上獲得了出色的峰型和優(yōu)異的靈敏度。
圖1. 硫脲標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖（1.00 μg/mL）
3.1.2 樣品溶劑的選擇
在HILIC模式下，采用80:20乙腈水作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液時，10.0 μg/mL硫脲標(biāo)準(zhǔn)品得到了尖銳且對稱的峰型。
圖2. 硫脲標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖（10.0 μg/mL）（A：稀釋溶劑為純水，B：稀釋溶劑為80:20乙腈水）
3.1.3 柱溫的選擇
當(dāng)色譜柱柱溫選擇20 ℃ 時，硫脲峰與雜質(zhì)峰可達(dá)到基線分離。同時，采集時間由10 min延長至12 min，可避免11 min左右的雜質(zhì)峰延遲至下一針進(jìn)樣時出峰。
圖3. 30℃ 柱溫，小麥粉空白基質(zhì)和0.20 μg/mL基質(zhì)加標(biāo)疊加色譜圖
圖4. 20℃ 柱溫，小麥粉空白基質(zhì)和0.20 μg/mL基質(zhì)加標(biāo)疊加色譜圖
3.2樣品前處理優(yōu)化
本次試驗中前處理流程為：稱取1.00 g小麥粉，加入10.00 mL 80:20乙腈水（提取溶劑與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶劑保持一致），渦旋混勻，高速冷凍離心，取上清液過膜，上機測試。處理一批次8個樣品，耗時約1小時。而標(biāo)準(zhǔn)推薦的前處理流程，在提取、過濾（離心）后，加入了旋蒸濃縮10 mL 80:20乙醇水提取液的操作，耗時較長，且樣品通量小。因此優(yōu)化后的前處理流程，提高了樣品通量，減少了溶劑用量，效率得到提升。
3.3線性范圍、方法檢出限及方法定量限
在優(yōu)化的色譜條件下，硫脲標(biāo)準(zhǔn)工作液線性范圍為0.20-5.00 μg/mL，線性方程y=0.9109x-0.0300，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.99992，線性關(guān)系良好。硫脲線性方程圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線點疊加色譜圖。在優(yōu)化前處理條件下，硫脲方法檢出限為2.0 mg/kg，定量限為5.0 mg/kg。
圖5. 硫脲線性方程圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線點疊加色譜圖
3.4回收率和精密度
小麥粉基質(zhì) 2.0、5.0、20.0 mg/kg 三水平加標(biāo)回收率范圍在 91.2%～95.0% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在 0.57%～2.36% 之間（n=6）
表1 小麥粉基質(zhì) 2.0、5.0、20.0 mg/kg
三水平加標(biāo)回收率范圍和精密度
圖6小麥粉基質(zhì) 2.0、5.0、20.0 mg/kg 三水平加標(biāo)回收率范圍和精密度
圖7小麥粉基質(zhì)中硫脲方法檢出限 MDL 濃度 (2.0 mg/kg) 加標(biāo)
圖8小麥粉基質(zhì)中硫脲方法定量限 LOQ 濃度 (5.0 mg/kg)加標(biāo)
圖9小麥粉基質(zhì)中硫脲10倍方法檢出限濃度 (20.0 mg/kg)加標(biāo)
04結(jié)論
本方法針對食品補充檢驗方法《小麥粉中硫脲的測定 BJS201602》進(jìn)行了優(yōu)化，簡化了前處理流程，優(yōu)化了色譜條件，線性范圍、方法檢出限及定量限、加標(biāo)回收率及精密度均能滿足方法確認(rèn)的要求。該方法簡單、便捷，適用于小麥粉中非法添加物硫脲的快速測定。
參考文獻(xiàn)：
[1] 國家糧食和物資儲備局辦公室. 關(guān)于《小麥》《小麥粉》國家標(biāo)準(zhǔn)公開征求意見的通知 國糧辦發(fā)[2019]330號[EB/OL]. http://www.lswz.gov.cn/html/zmhd/yjzj/2019-11/11/content_247627.shtml
[2] 總局關(guān)于進(jìn)一步加強小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告(2017年第132號)[J]. 現(xiàn)代面粉工業(yè),2017,31(06):28.
[3] 于鴻飛. 國內(nèi)外小麥粉標(biāo)準(zhǔn)的差異及我國現(xiàn)行小麥粉標(biāo)準(zhǔn)的修訂研究[D]. 西北農(nóng)林科技大學(xué),2011.
[4] 黃海霞,張真,吳金芝. 小麥多酚氧化酶特性及褐變控制研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(31):13574-13575,13638.
[5] GB 2760-2014. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S]. 2014
[6] 焦安浩. 硫脲的危險性及安全管理措施研究[J]. 化工管理,2021(07):95-96
[7] 總局關(guān)于發(fā)布食品中那非類物質(zhì)的測定和小麥粉中硫脲的測定2項檢驗方法的公告[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志,2017,29(01):25.
[8] Thermo Fisher Scientific Technical Guide 21003:HILIC Separations Technical Guide-A Practical Guide to HILIC Mechanisms, Method Development and Troubleshooting[A/OL]. https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets/CMD/brochures/TG-21003-HILIC-Separations-TG21003-EN.pdf . 2014
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