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平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法
動(dòng)物:大鼠150～180g,2～3只
操作步驟
大鼠頸椎脫臼致死
固定
消毒胸腹部
大組織鑷,組織剪切開胸腹部皮膚
另一組織鑷,組織剪切開胸腹部,并切除部分胸壁以利暴露
眼科鑷和眼科彎剪分離胸腹主動(dòng)脈并放入盛有Hank's液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)入無菌室.或先用生理鹽水漂洗,再放Hank's液中,轉(zhuǎn)入無菌室
眼科直鑷和彎鑷去除血凝塊和血管外膜層.
放入另一盛有Hank's液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,剪去血管外的小分支
放入含20%胎牛血清的DMEM中,眼科直剪剪開血管腔,以眼科彎鑷輕輕擦拭內(nèi)膜層,以去除內(nèi)皮細(xì)胞
放入另一含20%胎牛血清的DMEM中,用眼科彎剪剪碎血管組織至1mm
用吸管把組織塊轉(zhuǎn)入玻璃培養(yǎng)皿中,均勻貼壁,組織塊的間距為0.5cm
蓋好瓶蓋,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,讓瓶底朝上,并向瓶?jī)?nèi)注入適量培養(yǎng)液,于37 C孵箱內(nèi)放置4～5小時(shí),使得組織塊干涸,并與瓶底貼附
將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放,使組織塊*浸入培養(yǎng)液中,繼續(xù)靜置3～5天,切勿移動(dòng).待有細(xì)胞從組織塊周圍游離出后換液
平滑肌細(xì)胞傳代
傳代時(shí)間:大部分組織塊長(zhǎng)出細(xì)胞暈,并與相鄰細(xì)胞暈相接觸時(shí)就可以傳代
傳代步驟:
倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液
用D-Hank's液洗兩遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液,平放培養(yǎng)瓶,在倒置纖微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,可見到細(xì)胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大時(shí)迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫離消化液
注意:
初次傳代對(duì)胰酶敏感,加入消化液30s,即消化充分,以后2分鐘左右
細(xì)胞消化完成后,用吸管反復(fù)抽吸打散細(xì)胞
中止消化:加入DMEM培養(yǎng)液3滴管,用吸管反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞
離心:1500 X5分鐘
倒掉液體,加D-Hank's液洗一次,再加10mL DMEM培養(yǎng)液,用吸管抽吸吹打分散細(xì)胞,分裝于2個(gè)培養(yǎng)瓶.在倒置纖微鏡下可見圓形細(xì)胞.放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
血管平滑肌細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇
凍存時(shí)間:較早期傳代,以防細(xì)胞因?yàn)閭鞔螖?shù)過多而造成細(xì)胞衰老或發(fā)生改變,以保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性.
凍存方法:凍存前24小時(shí)更換培養(yǎng)液,凍存時(shí)要將密閉好的凍存管依次放于:
4 C 2小時(shí)
-20 C 2.5小時(shí)
液氮表面 2小時(shí)
浸入液氮
培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定
1,形態(tài)學(xué)鑒定:
用相差顯微鏡常規(guī)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)以及生長(zhǎng)規(guī)律.并依據(jù)常規(guī)制作電鏡標(biāo)本進(jìn)行觀察
電鏡觀察結(jié)果:細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,胞漿內(nèi)有肌絲,縱向排列,有密區(qū),具備平滑肌細(xì)胞特征
2,免疫組織化學(xué)鑒定:
特異性鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體,采用SP法對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色
免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果:
鏡下觀察到細(xì)胞爬片,可見細(xì)胞漿內(nèi)大量平行陽(yáng)性染色胞核不著色.所有細(xì)胞染色,結(jié)果均為陽(yáng)性
培養(yǎng)試劑的配制
Hank's液 （單位g）
CaCl2 0.14
KCl 0.4
KH2PO4 0.06
MgSO4.7H2O 0.10
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.12
D-glucose 1.0
Phenol red 0.01
將 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中,其它成分溶在750 mL的ddH2O中,混勻（用磁力攪拌器攪拌至溶解）,定容至1000mL.高壓蒸氣消毒10分鐘,4℃冰箱保存.
D-Hank's液 （單位:g）
KCl 0.40
KH2PO4 0.06
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.08
Phenol red 0.02
將以上成分溶于900mL ddH2O中,充分混勻,加ddH2O至1000 mL.高壓蒸氣消毒10分鐘,4℃冰箱保存.
青霉素,鏈霉素液配制
青霉素80萬(wàn)U加Hank's液至80 mL,終濃度1萬(wàn)u/ mL
鏈霉素100萬(wàn)U（相當(dāng)于1g）加Hank's液至100 mL,終濃度10mg/mL
分裝后至-20℃冰箱保存.
DMEM培養(yǎng)液
900 mL ddH2O于1000 mL容器中,將DMEM粉1包倒入容器中,盛粉袋用50 mL ddH2O分次沖洗,也倒入容器,磁力攪拌溶解.
加NaHCO3
調(diào)PH至7.2
加青,鏈霉素至終濃度100u/mL 和100ug/mL
0.22umX50濾膜過濾（負(fù)壓泵抽吸）,4℃冰箱保存.
小牛,胎牛血清滅活
55℃水浴箱30分鐘,置4℃冰箱保存
滅活前放于-20℃冰箱保存待用
臨用前加入DMEM液中
血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCS ）位于動(dòng)脈壁中膜，它對(duì)管壁的完整性和調(diào)節(jié)血管的緊張性起著重要作用.在經(jīng)典的單層培養(yǎng)系統(tǒng)中，VSMCS 離開了在體內(nèi)與細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的三維立體生長(zhǎng)環(huán)境，因而所表現(xiàn)出的生物學(xué)特性與在體狀態(tài)存在較大的差異.我們?cè)赩SMCS 單層培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將兔主動(dòng)脈VSMCS 置于膠原凝膠中，使其在體外與細(xì)胞外基質(zhì)形成一個(gè)整體，觀察其在三維狀態(tài)下的生物學(xué)特征，為構(gòu)造結(jié)構(gòu)和功能與在體血管中膜相似的中膜組織，zui終形成組織工程化血管提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).
動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)
一、血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)
血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有貼塊法（explant）和酶解離法（enzyme disperse）。貼塊法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高，量多，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。但用貼塊法易使平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失，亞細(xì)胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細(xì)胞間失去連接，細(xì)胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)。培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動(dòng)脈段。
1．貼塊法
方法：動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈放血后，在無菌操作下迅速取出胸腹主動(dòng)脈段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開血管，刮除內(nèi)膜即內(nèi)皮細(xì)胞迅速撕下中膜內(nèi)、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank's液中，并將撕下小組織塊種植于培養(yǎng)瓶壁。置于37℃恒溫箱，2h左右，取出培養(yǎng)瓶加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)4天。4天后可見細(xì)胞從組織中遷移游出。
不同動(dòng)物血管結(jié)構(gòu)有差異，豬和猴較易操作，但小動(dòng)物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特點(diǎn)，使之難以分離。另外組織塊太薄，不易粘附培養(yǎng)基，也使細(xì)胞較難生長(zhǎng)。為了保證培養(yǎng)的成功，應(yīng)注意：①種植組織塊的數(shù)目，如75cm2的長(zhǎng)頸瓶組織塊不得少于30 ；②根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應(yīng)加胎牛血清（FBS），通常濃度為10%～20%；③培養(yǎng)基的選擇：常用的有DMEM（Dulbecco's modified Eagles'medium），M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)兔的平滑肌細(xì)胞用DMEM效果較好。
2．酶解離法
沿動(dòng)脈縱軸切開后，刮除內(nèi)皮細(xì)胞撕下中膜的內(nèi)2/3，注意不要混入內(nèi)皮細(xì)胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養(yǎng)基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重復(fù)上述消化步驟，然后再離心（9000r,4min），收集細(xì)胞，在5%～10%同種血清或胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)入30～90mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，對(duì)于兔子應(yīng)加入高濃度的谷氨酰胺（0.2g/L）較佳。不同研究者在培養(yǎng)基、酶濃度以及消化時(shí)間等的選擇都有很大的差異。
二、動(dòng)脈平滑肌的特性
由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細(xì)胞培養(yǎng)的zui初階段細(xì)胞形態(tài)和性質(zhì)存在差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)環(huán)境趨于一致，細(xì)胞特性上也趨于近似。
光學(xué)倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細(xì)胞形狀多樣，一般常為梭形、帶形、三角形或星形。貼塊法培養(yǎng)，細(xì)胞可于2周后長(zhǎng)成單層；而酶解離只需6～7天，鏡下可見明顯“峰-谷”樣生長(zhǎng)。
透射電子顯微鏡下觀察：貼塊法，細(xì)胞多為合成型，肌絲減少，胞體縮小，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、線粒體等亞細(xì)胞器逐漸增多。消化法，細(xì)胞初期表現(xiàn)為收縮型，細(xì)胞內(nèi)核位于中心，胞質(zhì)內(nèi)含豐富的肌絲及致密度體。亞細(xì)胞器少，且位于細(xì)胞邊緣處，基底膜zui初未見，后來逐漸形成。傳代后，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)為合成型，胞體增大且變扁平，核增大，核小體數(shù)目增加，亞細(xì)胞器也增加，肌絲開始減少，占胞內(nèi)35.4%～11.5%,甚至更少。
另外，在體外實(shí)驗(yàn)中，來自幼齡動(dòng)物（兔，豬）的血管平滑肌增殖生長(zhǎng)早且快，相反，老齡動(dòng)物則生長(zhǎng)緩慢。在生化性質(zhì)方面，收縮型細(xì)胞比合成型細(xì)胞的β-極密度脂蛋白（β-VLDL）對(duì)其受體結(jié)合能力強(qiáng)，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂質(zhì)容易在胞質(zhì)沉著。此外，像基底膜中的肝素樣物質(zhì)、膽固醇代謝等也有改變。合成型細(xì)胞內(nèi)色素C氧化還原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加，說明兩類細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)上，在生化、生理反應(yīng)方面也發(fā)生了較大改變。
