1. 概述
二抗用于通過與熒光團或酶的偶聯(lián)來可視化與靶標結(jié)合的一抗的定位。在選擇哪種二抗*適合實驗時，需要考慮多種因素，包括：
目標和宿主物種
靶標抗體類別
純化和/或交叉吸附
結(jié)合
用于的應用程序
可用的成像設備
多路復用
是否需要三級檢測系統(tǒng)
2. 選擇正確的目標和物種
二抗總是針對特定物種的抗體提出。選擇二抗時，應確保：
3. 凈化
您應確保二抗已以*認的方式純化。最常見的純化方法之一是通過蛋白A或G親和色譜，其中蛋白A和G與色譜柱中的樹脂結(jié)合并與免疫球蛋白特異性結(jié)合，同時洗滌血清中的其他蛋白質(zhì)。
交叉吸附是指針對一系列非靶蛋白和免疫球蛋白篩選二抗。二抗通過含有固定化非靶蛋白的色譜柱，只有二抗沒有交叉反應性通過色譜柱。此步驟減少了脫靶結(jié)合，從而減少了免疫化學實驗中的背景染色。
4. 如何選擇合適的偶聯(lián)物
4.1 蛋白質(zhì)印跡
首先要做的是讓自己了解可用的檢測設施，因為這將決定哪種偶聯(lián)物可能是*好的。三種主要的檢測系統(tǒng)包括：
有關不同檢測系統(tǒng)的概述，請參見圖1和表1。
圖1.可用于蛋白質(zhì)免疫印跡的檢測方法概述
檢測方法 | 二級偶聯(lián)物 | 基質(zhì) | 考慮 |
增強型化學發(fā)光 （ECL） | 辣根過氧化物酶 | 基于魯米諾的ECL檢測解決方案 | 基于 HRP 的系統(tǒng)通常更靈敏且更易于使用 |
堿性磷酸酶 （AP） | 基于吖啶和1,2-二氧雜環(huán)丁烷的ECL檢測解決方案 |
顯 色 | 辣根過氧化物酶 | 3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 （TMB）、氯-1-萘醇 （4CN） 或 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺 （DAB） | 通常靈敏度低于ECL，更難使用。允許多路復用。 |
堿性磷酸酶 （AP） | 硝基藍四唑（NBT）或5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP） |
熒光 | 熒光基團（例如Alexa Fluor 680） | 那 | 多路復用和信號的持續(xù)時間可以比 ECL 更長 |
表 1.蛋白質(zhì)免疫印跡檢測方法摘要
4.1.1 增強化學發(fā)光
增強型化學發(fā)光 （ECL） 利用辣根過氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 偶聯(lián)的二抗來催化產(chǎn)生光的反應。這是通過過冷CCD傳感器或X射線膠片檢測的，可以可視化印跡。
HRP偶聯(lián)次級因其即時信號生成和比AP偶聯(lián)次級更高的靈敏度而被*廣泛使用。使用AP偶聯(lián)副反應時的另一個考慮因素是它們與磷酸鹽緩沖液不兼容。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應與含有NaN的溶液一起使用3.
由于僅發(fā)射單一波長的光，因此不可能進行多重檢測，除非蛋白質(zhì)靶標以不同的分子量存在，從而可以在同一膜上同時探測多個靶標（例如見圖2）。如果多個靶標的分子量相似，則需要剝離并重新探測印跡。
圖2.使用抗體檢測不同分子量靶標的ECL示例。使用小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）和小鼠單克隆抗GAPDH（HB9177）探測從各種組織裂解物轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的膜。使用與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠多克隆抗體完成可視化。由于NFL和GAPDH的分子量不同，這使得多路復用變得容易。NFL和GAPDH的不同信號強度需要不同的曝光時間，這意味著每個目標都需要單獨的面板。
4.1.2 顯色檢測
顯色檢測利用HRP和AP偶聯(lián)抗體催化反應，導致沉淀到膜上的有色最終產(chǎn)物。HRP的常見底物有：
3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：產(chǎn)生具有高信噪比的藍色產(chǎn)品
氯-1-萘醇（4CN）：產(chǎn)生紫藍色產(chǎn)品。但是穩(wěn)定性和靈敏度的問題
3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）：產(chǎn)生棕色產(chǎn)品，可使用金屬離子增強。但是穩(wěn)定性有問題。
AP 的常見基板有：
AP反應可以通過與酸性溶液孵育來停止，因此允許與不同顏色的反應產(chǎn)物進行多重反應。然而，AP共軛次級器件通常不如HRP檢測系統(tǒng)敏感，因此使用頻率要低得多。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應與含有NaN的溶液一起使用3.
4.1.3 熒光檢測
熒光檢測利用熒光團偶聯(lián)的二抗來檢測蛋白質(zhì)條帶。由于PVDF在較低波長下自發(fā)熒光，用于WB檢測的熒光團往往具有高度紅移。ICC/IHC和WB中常用的熒光團列表詳見表1。請參閱成像系統(tǒng)規(guī)格，查找熒光團與激發(fā)/發(fā)射波長兼容的組合。
與ECL相比，熒光檢測的靈敏度較低，但通過使用具有足夠不同的激發(fā)/發(fā)射波長的熒光團可以輕松進行多重檢測。隨著時間的推移，熒光信號也比ECL信號更穩(wěn)定，允許輕松重新成像，同時比ECL檢測變化更小，因為它不依賴于可能受多種因素影響的酶促反應。
4.2 免疫組織化學/免疫細胞化學
免疫組織化學和免疫細胞化學利用熒光或顯色介導的檢測。方法之間的選擇將取決于樣品制備、實驗目標和設備可用性（概述見表2和圖3）。
檢測方法 | 二級偶聯(lián)物 | 優(yōu)勢 | 弊 |
顯 色 | 辣根過氧化物酶 堿性磷酸酶 （AP） | 通過信號放大實現(xiàn)更高的靈敏度 最終產(chǎn)品穩(wěn)定性更高，允許更長的載玻片存儲時間 | 更耗時 更難多路復用 |
熒光 | 熒光基團（例如Alexa Fluor 488或DyLight 594） | 輕松多路復用 更快的實驗方案 高動態(tài)范圍 | 信號僅在幾天內(nèi)穩(wěn)定 某些組織中可能存在自發(fā)熒光問題。 熒光團可以光漂白 |
表 2.免疫組織化學和免疫細胞化學檢測方法概述。
圖3.可用于免疫組織化學和免疫細胞化學的檢測方法概述
4.2.1 熒光介導檢測
熒光介導檢測因其高度的靈活性和易于多路復用而非常受歡迎（例如參見圖4）。這種易于多路復用也使熒光檢測適用于共定位蛋白的分析。為免疫組織化學和免疫細胞化學選擇熒光團/熒光團對的第一步是檢查將用于成像的顯微鏡的規(guī)格。寬視場顯微鏡通常只配備有限的激發(fā)和發(fā)射濾光片，這將限制熒光團的選擇，而共聚焦顯微鏡通常受到可用于激發(fā)的激光通道數(shù)量的限制。激發(fā)和發(fā)射濾光片的激發(fā)和發(fā)射波長范圍需要與熒光團的激發(fā)和發(fā)射光譜重疊。有關IHC/ICC中常用熒光團（包括復染劑）的列表，請參見表3。
圖4.使用熒光檢測的免疫細胞化學示例。小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）與DyLight 488偶聯(lián)多克隆山羊抗小鼠二抗配對，用于檢測利用DAPI（HB0747）作為復染劑的培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元中的神經(jīng)絲，以可視化DNA。
Dye | Maximal absorbance wavelength (nm) | Maximal emission wavelength (nm) | Visible Colour |
Alexa Fluor 350 | 346 | 442 | Blue |
Hoechst 33342 | 350 | 461 | Blue |
Hoechst 33258 | 352 | 461 | Blue |
DyLight 350 | 353 | 432 | Blue |
DAPI | 358 | 461 | Blue |
DyLight 405 | 400 | 420 | Blue |
Alexa Fluor 405 | 401 | 421 | Blue |
Alexa Fluor 430 | 433 | 541 | Green / Yellow |
EGFP | 488 | 507 | Green |
Cy2 | 489 | 506 | Green |
FITC | 492 | 520 | Green |
DyLight 488 | 493 | 518 | Green |
Alexa Fluor 488 | 496 | 519 | Green |
Alexa Fluor 532 | 532 | 553 | Yellow |
Cy3 | 550 | 570 | Yellow |
Alexa Fluor 546 | 556 | 573 | Orange |
Alexa Fluor 555 | 555 | 565 | Orange |
DyLight 550 | 562 | 576 | Orange |
TRITC | 557 | 576 | Orange |
Alexa Fluor 568 | 578 | 603 | Orange / Red |
Cy3.5 | 581 | 594 | Orange / Red |
mCherry | 587 | 610 | Red |
Texas Red | 589 | 615 | Red |
Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Red |
DyLight 594 | 593 | 618 | Red |
Alexa Fluor 610 | 612 | 628 | Red |
Alexa Fluor 633 | 632 | 647 | Far Red |
DyLight 633 | 638 | 658 | Far Red |
Alexa Fluor 635 | 633 | 647 | Far Red |
DRAQ5 | 646 | 697 | Far Red |
Alexa Fluor 647 | 650 | 665 | Far Red |
Cy5 | 650 | 670 | Far Red |
DyLight 650 | 652 | 672 | Far Red |
Alexa Fluor 660 | 663 | 690 | Far Red |
Cy5.5 | 675 | 694 | Far Red |
Alexa Fluor 680 | 679 | 702 | Near Infrared |
IRDye 680 | 680 | 694 | Far Red |
IRDye 700 | 680 | 697 | Far Red |
DyLight 680 | 692 | 712 | Near Infrared |
Alexa Fluor 700 | 702 | 723 | Near Infrared |
Cy7 | 743 | 767 | Near Infrared |
Alexa Fluor 750 | 749 | 775 | Near Infrared |
DyLight 755 | 754 | 776 | Near Infrared |
IRDye 750 | 766 | 776 | Near Infrared |
DyLight 800 | 777 | 794 | Near Infrared |
Alexa Fluor 790 | 784 | 814 | Near Infrared |
IRDye 800RS | 770 | 794 | Near Infrared |
IRDye 800CW | 778 | 786 | Near Infrared |
表 3.熒光免疫組化和免疫細胞化學常用的一些熒光團和復染劑總結(jié)
通過使用具有不同激發(fā)/發(fā)射光譜的成對熒光團來實現(xiàn)多路復用。在選擇熒光團對時，確保它們沒有重疊的激發(fā)/發(fā)射光譜至關重要（參見圖5，了解用于多重檢測的熒光團成功組合的示例）。如果熒光團的發(fā)射光譜重疊，則通道可能會滲入另一個通道，從而難以分辨來自哪種抗體的信號。雖然一些**的分析軟件能夠糾正這一點，但僅使用一個熒光基團的對照通常很有幫助，以便可以輕松檢測滲漏。
圖 5：用于多重實驗的合適熒光團組合示例。激發(fā)和發(fā)射光譜之間的重疊最小，這意味著成像時信號不太可能在通道之間滲漏。
4.2.2 顯色檢測
顯色檢測利用堿性磷酸酶（AP，使用 3-氨基-9-乙基咔唑 （AEC） 作為底物）或辣根過氧化物酶（HRP，使用 3,3' 二氨基聯(lián)苯胺 （DAB） 作為底物）介導的反應催化，導致有色底物沉積在組織切片上。由于這種彩色基材不會降解，這意味著載玻片可以保存數(shù)月而不會明顯損失信號強度。由于酶反應充當擴增步驟，顯色檢測具有很高的靈敏度，但是除非靶標位于不同的細胞類型或位置，否則很難進行多重檢測。在這種情況下，可以使用具有不同反應產(chǎn)物的底物成功多重。
5. 三級檢測
當靶標以低豐度表達或其檢測存在其他問題時，一種可能性是使用三級檢測系統(tǒng)。這些利用鏈霉親和素和生物素之間的*高親和力，在免疫化學過程中增加了另一個步驟。三級檢測使用生物素偶聯(lián)的二抗，然后由熒光團或酶偶聯(lián)的鏈霉親和素結(jié)合。這增加了一個額外的擴增步驟，因此在以前使用其他檢測方法的實驗不成功的情況下非常有用。
