人熱休克蛋白70（HSP-70）ELISA試劑盒使用說明書
人熱休克蛋白70（HSP-70）ELISA試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
檢測范圍:0.156ng/ml - 10 ng/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請(qǐng)取用以下濃度值:10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml，0.312ng/ml，0.156ng/ml。
zui低檢測限：0.039 ng/ml
特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人HSP-70，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中HSP-70含量。
實(shí)驗(yàn)原理:用純化的HSP-70抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的HSP-70抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HSP-70呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（ 值），計(jì)算樣品濃度。
人熱休克蛋白70（HSP-70）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶標(biāo)板:一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）:2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為10ng/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml，0.312ng/ml，0.156ng/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/ml。如配制5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml）10 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液:1×20ml。
4.檢測稀釋液A:1×10ml。
5.檢測稀釋液B:1×10ml。
6.檢測溶液A:1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A/990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。
7.檢測溶液B:1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液:1×10ml/瓶（2mol/LH2SO4）。
11.覆膜:5張
12.使用說明書:1份
自備物品:
1.酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
2.微量加液器及吸頭，EP管
3.蒸餾水或去離子水，濾紙
標(biāo)本的采集及保存:
1.血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4 過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4 保存應(yīng)小于1周，-20 不應(yīng)超過1個(gè)月，-80 不應(yīng)超過2個(gè)月；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37溫育2小時(shí)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效
性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。
3.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。
5.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6.每孔加底物溶液90,酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。
7.每孔加終止溶液50，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。
8.立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（ 值）。
注：
1.試劑準(zhǔn)備:所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請(qǐng)立即按照說明書要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.加樣:加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3.溫育:為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
4.洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5.試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時(shí)，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6.反應(yīng)時(shí)間的控制:加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7.底物:底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
洗板方法:
1.手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
2.自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
計(jì)算:各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則 應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）， 值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert1.3，根據(jù)樣品 值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
說明:
1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
2.zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
3.在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
4.試劑盒保存:請(qǐng)收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ，其余試劑短期保存請(qǐng)置于4 ，長期保存則置于-20。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20，避免潮濕。
5.濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
6.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
7.有效期:6個(gè)月。
