人基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP-12）ELISA試劑盒使用說明書
人基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP-12）ELISA試劑盒僅供體外研究使用!
實驗原理:用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗MMP-12抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗MMP-12抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-12呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
檢測范圍:0.156 ng/ml-10 ng/ml
zui低檢測限:0.039 ng/ml
預(yù)期應(yīng)用:
ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中MMP-12含量。
人基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP-12）ELISA試劑盒組成及試劑配制
1.酶聯(lián)板:一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）:2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10ng/ml，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）后，分別稀釋成10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml，0.312ng/ml，0.156ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制5ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml） 10 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液:1×20ml。
4.檢測稀釋液A:1×10ml。
5.檢測稀釋液B:1×10ml。
6.檢測溶液A:1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl/孔），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
7.檢測溶液B:1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液:1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
11.覆膜:5張
12.使用說明書:1份
自備物品:
1.酶標儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）;
2.微量加液器及吸頭，EP管;
3.蒸餾水或去離子水，全新濾紙;
標本的采集及保存:
1.血清:全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C 1000x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:以上標本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個月，-80℃不應(yīng)超過2個月；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟:
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試 劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加 檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進行檢測。
注：
1.試劑準備:所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.加樣:加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.孵育:為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶 標儀讀數(shù)。
5.試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7.底物:底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
洗板方法:
1.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
2.自動洗板:如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人MMP-12，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算:以標準物的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）,OD值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert1.3，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
說明:
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2.試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃，其余試劑短期保存請置于4℃，長期保存則置于-20℃。
3.濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
5.所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
6.有效期:6個月。
