人髓鞘堿性蛋白抗體（MBP-Ab）ELISA試劑盒說明書
人髓鞘堿性蛋白抗體（MBP-Ab）ELISA試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中MBP 抗體含量。
說明:
1.中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
2.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
3.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4.試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
實驗原理:用純化的MBP蛋白抗原包被微孔板，制成固相載體，向微孔中分別加入待測樣品，然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人的抗體進行反應(yīng)，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MBP Ab呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品中抗體的效價（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價）。
人髓鞘堿性蛋白抗體（MBP-Ab）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2.樣品稀釋液（Sample Diluent）：2×20ml/瓶。
3.辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（HRP-anti-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
4.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
5.濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
6.終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材:
1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.高速離心機
3.電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.干凈的試管和Eppendof管
5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存:
1.血清：全血標(biāo)本請于37° C放置1小時或4° C過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗的稀釋原則：臨用前用樣品稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗加990μl樣品稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟:
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔加待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60分鐘。
2.棄去液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液 100μl（按1μlHRP標(biāo)記抗體加99μl樣品稀釋液的比例配制，輕輕混勻）。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見陽性孔內(nèi)有明顯藍色，即可終止）。
5.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
6.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注：
1.用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液。
5.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法:
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
計算:為檢測樣品中MBP蛋白抗體效價，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計算抗體效價，一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進行稀釋）。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗要求而定，zui終顯色與陰性對照孔進行比較，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價。
注意事項:
1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.底物請避光保存。
6.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
特異性:本試劑盒可同時檢測天然或重組的人MBP抗體，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
有效期:6個月
