關(guān)鍵詞:酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*。
酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù) http://www.。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
原理
酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來，它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間的相互作用。(2）研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能，即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)。
ProQuest系統(tǒng)依靠報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來鑒定蛋白相互作用。將一個(gè)基因克隆到'誘餌'載體，pDEST32，并和GAL4蛋白的DNA結(jié)合域（DBD）表達(dá)為融合蛋白。將第二個(gè)基因或者編碼可能的相互作用子蛋白的cDNA文庫(kù)克隆到'獵物'載體，pDEST22，同GAL4的轉(zhuǎn)錄激活域（AD）表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩個(gè)蛋白相互作用時(shí)，AD和DBD間距離被拉近，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)
服務(wù)流程
1) 提取總RNA，分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。
2) 將cDNA與pDONR222載體進(jìn)行BP重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞。
3) 甘油保存大腸桿菌文庫(kù)。
4) 提取大腸桿菌文庫(kù)質(zhì)粒DNA，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞
5) 大腸桿菌文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化酵母菌，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率，
6) 收集酵母轉(zhuǎn)化子，測(cè)定文庫(kù)效價(jià)。
7) 甘油保存酵母菌文庫(kù)。
使用優(yōu)點(diǎn)： 在擁有相關(guān)組織基因文庫(kù)的情況下
1 ） 可以用來比對(duì)病變組織更快的找到突變基因或者導(dǎo)致變異的蛋白，更快的找到攻克方向。
2 ） 可以用作大規(guī)模的蛋白篩選，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)找到某些藥物對(duì)相關(guān)組織主要的作用蛋白，對(duì)于藥物的修飾和改進(jìn)明確方向。
3 ） 可以反復(fù)使用，培養(yǎng)時(shí)間短，適合大規(guī)模篩選使用。
4 ） 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。
5 ） 檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。
注意事項(xiàng)
1. RNA 的提?。ɡ绠惲蚯杷犭曳ǎ}酸胍—有機(jī)溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定）。
2. 要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的 cDNA 文庫(kù)，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時(shí)必須仔細(xì)小心。
3. 由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無 RNA 酶的環(huán)境對(duì)于制備 RNA 很重要。
4. 文庫(kù)構(gòu)建要選擇合適的載體，常規(guī)用的是 λ 噬菌體，這是因?yàn)?λ DNA兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA。
5. 膠回收前電泳槽，電泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡。
6. 膠回收時(shí)電壓要穩(wěn)定。
