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            樹(shù)脂切片制作過(guò)程

            來(lái)源:海德創(chuàng)業(yè)(北京)生物科技有限公司   2016年11月25日 15:29  

            一、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

            1.器具電子天平、70℃恒溫箱、玻璃制刀機(jī)、半/超薄切片機(jī)、顯微鏡、包埋模、制刀用的玻璃條、鑷子、刀片。

             

            2.試劑

             (1)固定劑FAA

             (2)脫水劑20%、40%、60%、80%、90%95%、100%的乙醇;丙酮

            (3)樹(shù)脂Spurr樹(shù)脂

            (4)染色劑:1%堿性品紅

            二、實(shí)驗(yàn)步驟

            1.取材和固定取樣時(shí)所用的器具必須干凈,刀、剪等必須鋒利,在操作時(shí)盡量避免拉、鋸、壓等動(dòng)作對(duì)組織細(xì)胞造成的機(jī)械損傷。一般樣品塊的大約為1立方毫米,取材完成后立即放入固定液中,真空泵抽氣兩到三次,每次1-2min(注意不要讓固定液沸出,如抽完后液體較少,可再補(bǔ)加固定液)。

            2.脫水:50%、60%、70%85%95%、100%的乙醇分別浸漬固定的材料,每種濃度處理1015min

            3.置換

            (1)在管瓶中加入2ml無(wú)水乙醇和1ml丙酮,處理材料10min

            (2)向管瓶中追加1ml丙酮,處理材料10min

            (3)向管瓶中再追加2ml丙酮,處理材料10min

            (4)傾倒出管瓶中的無(wú)水乙醇和丙酮混合液,加入純丙酮3次,每次10min

            4.浸透

            (1)在管瓶中加入1ml丙酮,向內(nèi)滴入1Spurr樹(shù)脂,12h

            (2)向管瓶中追加1至數(shù)滴Spurr樹(shù)脂,使Spurr樹(shù)脂的濃度逐漸提高,每滴加一Spurr樹(shù)脂,放置12h,共滴加0.3ml左右的樹(shù)脂,使樹(shù)脂濃度達(dá)到25%右。

            (3)用吸管吸去管瓶中0.50.8ml的丙酮和Spurr樹(shù)脂的混合液,然后加入純Spurr樹(shù)脂0.5ml,使樹(shù)脂濃度達(dá)到50%60%左右,23h

            (4)用吸管吸去管瓶中的丙酮和Spurr樹(shù)脂的混合液,加入0.50.8mlSpurr樹(shù)脂,23h

            (5)更換新配制的Spurr樹(shù)脂1ml,過(guò)

            (6)重復(fù)換樹(shù)脂3次,每次12h

            5.包埋與聚合

            (1)先將恒溫箱調(diào)至溫度至70℃,包埋模事前烘干置干燥器中存放。

            (2)在濕度小的房間里進(jìn)行包埋操作。在包埋模的中放上已浸透的材料(用牙簽不損傷樣品地桃),用滴管吸取新配制的Spurr樹(shù)脂,并注滿每個(gè)穴孔,用牙簽撥樣品,使樣品按一定方位(有利修塊、切片和觀察)排列。做好記載(各穴孔中放的是什么樣品

            (3) 聚合:將包埋樣品的包埋模放入70℃恒溫箱中聚合,8h后取出置干燥器中存放。多余的樹(shù)脂可放在膠囊中或放在包埋模的穴孔中同樣品一同聚合。

            6.修塊

            用銼刀或鐵砂皮磨樣品塊,使樣品稍稍暴露,使待切部位呈方形或長(zhǎng)方形,zui后用刀片將樣品塊的磨面切平

            7.玻璃刀的制作

            用玻璃制刀機(jī)先將玻璃條制成邊長(zhǎng)為25mm的正方塊,然后再將每正方塊制作成2把璃制刀。

            8.切片、貼片

            (1)固定樣品塊和玻璃刀

            將樣品塊和玻璃刀固定在半薄切片機(jī)上,玻璃刀的避樣品角約為5度,切片機(jī)裝樣品部位平放時(shí),玻璃刀刀口與樣品塊處于同一高度。調(diào)節(jié)玻璃刀前后位置,使刀口接近樣品塊。

             (2)荒切

            開(kāi)動(dòng)切片機(jī),調(diào)節(jié)進(jìn)刀距離和速度,讓玻璃刀荒切樣品塊,使樣品塊的切面逐漸平整光滑起來(lái)。

            (3)切片

            當(dāng)樣品塊的切面平整光滑后便可正式切片。作為光鏡觀察用的半薄切片厚度一般控制在1-2μm左右。

            (4)貼片

            當(dāng)切到理想切片時(shí),用尖頭鑷子夾住切片,并把切片釋放到滴有水滴的載玻片的水滴上,然后將載玻片放到烤片機(jī)上45℃烤片,當(dāng)載玻片上的水滴被烤干時(shí)切片就被貼在載玻片上。

            (5) 將堿性品紅染液均勻覆蓋在載玻片上,45℃烤干,隨后用50%乙醇沖洗,并再次把切片烘干。

            (6)封片,觀察

            注意:透射電鏡樣品固定液為2.5%戊二醛溶液

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