重磅！利用CRISPRi鑒定出細(xì)胞生長(zhǎng)所需的499個(gè)lncRNA

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類神秘的長(zhǎng)200多個(gè)核苷酸但不會(huì)編碼任何蛋白的分子。如今，在一項(xiàng)新的研究中，研究人員鑒定出499個(gè)lncRNA是功能性的，并且在理解這些分子如何發(fā)揮作用方面取得重大進(jìn)展。他們報(bào)道，不同于大多數(shù)蛋白編碼基因---它們往往是眾多細(xì)胞系所必需的---的是，針對(duì)測(cè)試的6種細(xì)胞系，在鑒定出的lncRNA中，將近90%的lncRNA似乎影響僅僅其中的一種細(xì)胞系的強(qiáng)勁生長(zhǎng)。相關(guān)研究結(jié)果于2016年12月15日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells”。

論文共同通信作者、美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校神經(jīng)科學(xué)家Daniel Lim說(shuō)，“lncRNA是一類非常神秘的轉(zhuǎn)錄本，在大多數(shù)細(xì)胞中大量地存在。人們并不清楚的是，存在多少數(shù)量的lncRNA，而且哪些lncRNA在基礎(chǔ)生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。我們吃驚地發(fā)現(xiàn)…大多數(shù)lncRNA僅在一種細(xì)胞類型中發(fā)揮功能。”

之前的研究已證實(shí)某些lncRNA在細(xì)胞功能、發(fā)育和疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。美國(guó)哈佛大學(xué)lncRNA研究專家John Rinn（未參與這項(xiàng)研究）說(shuō)，“十年多來(lái)，我們已知基因組的大部分經(jīng)轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生lncRNA。幾個(gè)研究團(tuán)隊(duì)已證實(shí)幾十種lncRNA確實(shí)是細(xì)胞和甚至有機(jī)體活力所必需的。”

但是除了這些研究外，人們對(duì)lncRNA如何發(fā)揮功能知之甚少。論文共同通信作者、加州大學(xué)舊金山分校細(xì)胞與分子藥理學(xué)教授Jonathan Weissman說(shuō)，“我們并不知道的是，它們?nèi)绾伟l(fā)揮功能和它們往往在哪些細(xì)胞類型中發(fā)揮功能。我們并沒(méi)有對(duì)lncRNA的生物學(xué)重要性獲得良好的認(rèn)識(shí)，而且我們僅有有限的工具來(lái)試圖解決這些問(wèn)題。”

為此，Lim、Weissman和同事們開發(fā)出一種CRISPR干擾（CRISPR interference, CRISPRi）平臺(tái)，這種平臺(tái)靶向7種不同的細(xì)胞系---6種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系和一種人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞---中的16,401個(gè)lncRNA位點(diǎn)。通過(guò)利用他們的這種經(jīng)過(guò)修飾的CRISPR技術(shù)抑制每個(gè)候選lncRNA的表達(dá)從而對(duì)上千個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行篩選之后，他們鑒定出499個(gè)lncRNA位點(diǎn)是強(qiáng)勁的細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的，其中89%的位點(diǎn)似乎僅在一種細(xì)胞類型中發(fā)揮功能。

Lim說(shuō)，“這種技術(shù)的力量真地是由CRISPRi提供的。我們能夠關(guān)閉這些非編碼轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄。”為了讓CRISPRi篩選平穩(wěn)地開展，研究人員也為每個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建出由10個(gè)向?qū)NA（gRNA）組成的文庫(kù)，因而共構(gòu)建出大約170,000種gRNA。他們將這種文庫(kù)命名為CRiNCL（CRISPRi noncoding library, CRISPRi非編碼文庫(kù)）。

研究人員寫道，zui為令人吃驚的是絕大多數(shù)lncRNA基因似乎改變僅一種細(xì)胞類型中的細(xì)胞生長(zhǎng)。Weissman說(shuō)，“不同于經(jīng)常在很多不同的細(xì)胞類型中發(fā)揮至關(guān)重要作用的蛋白編碼基因，這些僅在一種細(xì)胞中發(fā)揮至關(guān)重要作用的lncRNA很少會(huì)在其他的細(xì)胞類型中發(fā)揮著重要作用。這提示著lncRNA在給每個(gè)細(xì)胞賦予它自己的身份中發(fā)揮著作用。”

Rinn說(shuō)，“這項(xiàng)研究是在特定的細(xì)胞系中對(duì)lncRNA進(jìn)行全基因組篩選。依據(jù)這項(xiàng)研究，我們?nèi)缃衲軌蜃鞒鼋Y(jié)論：大多數(shù)lncRNA在細(xì)胞活力中發(fā)揮著重要作用，正如猜測(cè)中的那樣。但是如今，可以這么說(shuō)，一切還得實(shí)踐證明。”

他提醒道，仍不清楚的是這些鑒定出的499個(gè)lncRNA位點(diǎn)如何可能影響細(xì)胞生長(zhǎng)。Rinn說(shuō)，“這項(xiàng)研究格外仔細(xì)地控制全基因組篩選存在的多種不足之處。然而，這項(xiàng)研究并不能夠排除是這些lncRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮重要作用還是zui終的RNA產(chǎn)物才是一種功能性分子。”

Rinn補(bǔ)充道，這些發(fā)現(xiàn)可能zui終對(duì)靶向癌癥治療產(chǎn)生影響。他說(shuō)，“研究人員證實(shí)很多l(xiāng)ncRNA位點(diǎn)在細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用。因此，在發(fā)生細(xì)胞增殖的癌癥等疾病中，這些鑒定出的位點(diǎn)可能代表著一種開發(fā)基于RNA的療法的新方法。”